宿主通过复杂多样的防御系统抵御外界病原微生物的感染,近来研究发现在细菌体内存在一种新的防御系统——基于环状寡核苷酸的抗噬菌体信号系统(cyclic oligonucleotide-based antiphage signaling system,CBASS)。被噬菌体感染的细菌可通过CBASS系统启动个体细胞的自杀来阻止噬菌体的增殖,从而保护整个细菌群体。cGAS-DncV样核苷酸转移酶(CD-NTase)是CBASS系统内重要的组成部分,属于一类合成环核苷酸第二信使的免疫感知酶类。随着研究的进一步深入,发现CD-NTases广泛存在于细菌和哺乳动物细胞中。细菌CD-NTases能够激活级联系统并调控下游反应,从而启动细菌中的初始抗噬菌体反应。目前在细菌中发现的CD-NTases大约有5600多种,它们利用四种核糖核苷酸合成多种环状核苷酸,预测其产物多达180种。动物细胞中,cGAS被DNA激活后催化合成2’3’-cGAMP,随后激活STING,最终引发Ⅰ型干扰素的释放。cGAS的功能和催化机制已基本阐明,然而细菌CD-NTases的功能和活性调控机制仍然不够清楚,尚需进一步阐明。本文选取了来自食酸菌(Acidovorax temperans)且属于CD-NTa此网站ses家族G类环化酶的AtCdnG作为研究对象,通过蛋白质晶体学方法,进行相关结构和功能的初步研究。AtCdnG酶包含两个结构域,分别称为N端催化结构域和C端结构域。其中N端催化结构域与常见的细菌CD-NTases很相似,应为酶的催化核心,负责结合底物并催化环状核苷酸的合成。C端结构域为腺苷/鸟苷和SMODS C端识别结构域(AGS-C),预测其可能参与核苷酸的识别,但具体功能未知。通过一系列表达、纯化条件的尝试,获得了高表达的AtCdnG全长蛋白和截短体蛋白用于晶体搜索。最终,获得AtCdnG的N端结构域(1-349,简称AtCdnGΔC)及AtCdnGΔC-ATP复合物的高分辨率三维结构,分辨率分别为2.23 (?)和2.40 (?)。结构分析显示,AtCdnGΔC的三维结构呈经典的核苷酸转移酶双叶结构。前端α/β核心和后端螺旋束之间由一个长α螺旋(spine)连接。α/β核心包含位于一侧的六个Nasal mucosa biopsyα螺旋和一个中心扭曲的七股β片,C端螺旋束包含三个α螺旋和一对反向平行的β片。以DALI search进行蛋白质三维结构相似性搜索,结果显示与AtCdnGΔC三维结构相似的蛋白质均属于CD-NTase酶家族,其中最相似的蛋白为B.diazoefficiens CdnG(PDB号7LJN,Z score 27.5),与经典的 V.cholerae DncV(PDB 号 4U03,Z score 24.0)也很相似。将AtCdnGΔC与BdCdnG和VcDncV结构进行叠合,发现AtCdnGΔC结构与BdCdnG和 VcDncV 结构整体相似,但是 α7(resides:137-150),α9(residues:172-182)和α17(residues:249-261)三个位置存在明显差异,这可能与AtCdnGΔC为无活性状态及其和其他CD-NTLiproxstatin-1供应商ase酶的不同催化特性有关。通过生化实验完成了 AtCdnG的酶活初步表征。结果显示AtCdnG在体外仅能催化ATP进行反应,这表明AtCdnG对ATP具有较高的底物偏好性。此外,AtCdnG在体外能催化ATP产生多种产物,包括环腺苷酸、环二腺苷酸、环三腺苷酸和环四腺苷酸,且这些多环腺苷酸产物的连接方式可能与常见3’-5’的连接方式不同,还需进一步实验确认。突变体的生化实验结果证实NTase结构域是酶催化中心,三位突变体(D73N/D75N/D135N)完全丧失活性。令人意外的是,单独NTase结构域(1-349或1-379)无环化酶活性,仅有全长蛋白才有环化酶活性,表明C端结构域调控AtCdnG酶活性,C端结构域和N端催化结构域均是AtCdnG环化酶活性所必须的,这明显不同于已报道细菌的CD-NTase酶,它们一般仅由催化结构域组成且其在体外均有酶活性。基于以上实验结果,我们的主要结论如下:1.AtCdnGΔC的三维结构与已知NTase结构域相似,呈保守的双叶结构,但在活性中心附近也存在明显的差异,这可能与其催化特异性相关;2.AtCdnG底物偏好ATP,催化产物多样,且连接方式可能均为2’-5′;3.AtCdnG的C端结构域起着开关的作用,调控AtCdnG的环化酶活性,为首个报道需双结构域才有环化酶活性的细菌CD-NTase。总之,本论文的研究结果将为阐明AtCdnG的酶催化机制提供坚实的前期基础,同时也将为拓展细菌CBASS的功能机制研究提供理论基础。