癌症已成为高发病率和死亡率最高的疾病之一并时刻威胁着人类的生命健康。盐酸阿霉素(DOX)作为一种常用的广谱抗癌药物,其较佳的治疗效果在生物医药领域备受关注并已应用于临床。但又因其严重的心肌毒性和药物利用率低及缺乏选择性等问题而受到了限制。因此需要设计一种能够降低其对正常组织的毒副作用和协同其抗癌作用的治疗新体系。基于此,本课题以具有细胞毒性的中空纳米氧化铈(HCNPs)为药物载体,DOX作为模型药物,然后以具有肿瘤微环境(TME)响应性的聚丙烯酸(PAA)和叶酸修饰的牛血清白蛋白(BF)作为包封层构建了一种具有双重刺激响应性释药和靶向递送的多功能纳米载药系统。本课题所进行的研究内容如下:1、首先制备具有细胞毒性的HCNPs-NH_2纳米粒作为载药主体,以静电交联作用在纳米粒表面形成一层pH响应性的聚丙烯酸包封层,然后合成叶酸(FA)修饰的牛血清白蛋白,最后再通过酰胺反将谷胱甘肽(GSH)响应性的牛血清白蛋白连接在聚丙烯酸表面,从而制备出具有靶向双重刺激响应性的HCNPs-PAA-BF纳米载药系统。通过激光粒度及Zeta电位分析仪、透射电子显微镜、比表面及孔隙度分析仪、X射线粉末衍射仪、傅立叶变换红外光谱、紫外分光光度计、差热热重同步分析仪等对纳米颗粒的结构进行了表征。结果表明:所制备的HCNPs-PAA-BF纳米粒分散均匀,粒径均一,形貌类球形并具有良好的稳定分散性和明显的中空介孔结构。通过氮气吸附/脱附曲线算出HCNPs的表面积(SBET)为209.34 m~2/g,平均孔径(DBJH)为6.04 nm。通过X射线粉末衍射图确认了HCNPs的典型面心立方晶型结构,而PAA和BF的修饰没有造成二氧化铈单位晶胞的改变,仍保持了其原有的晶型,在衍射峰位面(111)前出现的宽峰是非晶型BSA的特征衍射峰,与红外光谱图和紫外光谱图及TGA曲线图相互验证了HCNPs-PAA-BF的成功制备。2、通过建立的高效液相色谱法对DOX的含量进行测定,并进行了方法学验证。对DOX的负载和药物在不同介质下的释放机理进行了研究。结果表明:建立的DOX含量测定方法专属性强,具有很好的精密度和重复性,建立的标准曲线具有很好的线性关系。而在药物负载时通过DOX与载体不同的质量比筛选出最佳配比,最终制备的载DOX纳米粒(DOX@HCNPs-PAA-BF)的载药量和包封率分别为32.2%、75.1%。体外释放实验表明DOX的释放量随释放介质pH值的降低而增加,并且累计释放曲线呈先快速释放后缓慢释放的趋势,DOX在含有5 m M GSH的pH 5.0 PBS缓冲液中的释放速度最快,在释放72 h后累计释放量达到了76.23%;而在pH 7.4 PBS缓冲液中DOX几乎无释放,但在加入5 m M GSH后,DOX在72 h后累计释放量达到了43.57%。体外释放实验结果表明:所制备的DOX@HCNPs-PAA-BF具有pH和GSH双重敏感释药的特性,并且药物在释放过程中具有先快速释药后缓慢持久释药的特性。DOX@HCNPs纳米粒经PAA和BF修饰后,避免了DOX在体内到达靶细胞前过早泄露,而到达高浓度GSH和低pH的肿瘤细胞微环境下HCNPs表面的PAA和BF包裹层发生裂解,暴露出具有细胞毒性的二氧化铈纳米粒并释放出DOX,从而避免损伤正常细胞并实现氧化铈纳米载体与抗肿瘤药物协同抗癌的目的。3、通过溶血性实验对所制备的DOX@HCNPs-PAA-BF进行体外安全性评价,采用MTT法、倒置荧光显微镜和流式细胞仪验证了DOX@HCNPs-PAA-BF的细胞毒性和其在不同时间下的胞内分布及其主动靶向性。溶血性实验结果证明了DOX@HCNPs-PAA-BF具有良好的生物相容性和安全性。MTT实验结果表明HCNPs-PAA-BF在15μg/m L～250μg/m L下对正常肝细胞(HL-7702)没有毒性,而对肝癌细胞(HepG2)和乳腺癌细胞(MDA-MB-231)具有细胞毒性作用,在48 h内存活率均低D-Lin-MC3-DMA使用方法于80%。说明HCNPs-PAA-BF纳米粒生物相容性好且能协同抗癌。游离DOX和DOX@HCNPs-PAA-BF的MTT实验结果表明:制备的DOX@HCNPs-PAA-BF对肿瘤细胞有明显的杀伤作用且随着时间的延长,对肿瘤细胞的杀伤作用明显强于游离DOX。采用倒置荧光显微镜和流式细胞仪相互验证了DOX@HCNPs-PAA-BF的主动靶向性,通过竞争抑制实验发现提前用FA预孵育后,MDA-MB-231细胞的摄取量明显减少,荧光强度减弱。证实了DOX@HCNPs-PAA-BF是通过FA受体介导的内吞作用进入肿瘤细胞内的,具有特异性靶向肿瘤细胞递送药物的能力。4、以乳腺癌MDA-MB-231为细胞模型,通过倒置荧光显微镜观测细胞的摄取行为并结合高效液相色谱法对细胞的摄取和消除过程进行定量确认细节分析。结果表明,在细胞摄取过程中培养4 h后DOX已全部进入到了细胞核中,且随着时间延长,细胞内荧光强度不在增强;而在细胞消除实验中替换含药培养液10 h后观察到DOX@HCNPs-PAA-BF的消除速率明显慢于游离DOX,能够在细胞内长时间的滞留。以高效液相色谱法测定细胞内DOX的含量并进行细胞动力学研究。按照药物动力学单室模型和统计矩计算,结果表明DOX@HCNPs和DOX@HCNPs-PAA-BF相对于DOX来说药动学参数均得到了改善。通过比较,DOX@HCNPs-PAA-BF的Ke从游离DOX的1.25 h~(-1)减小到了0.195h~(-1),t_(1/2)从0.555 h延长到了3.557 h,MRT从2.646 h增加至4.506 h。结果证明了HCNPs-PAA-BF负载DOX能够很好的延长药物在细胞内的滞留时间改善药物细胞动力学行为从细胞水平上快速预测和评价药物的治疗作用,从而达到良好的协同抗癌效果。5、通过细胞对药物摄取机制的定量研究,以不同时间、不同给药浓度、不同温度和载体饱和及不同内吞抑制剂对DOX@HCNPs-PAA-BF纳米粒进入细胞的途径进行研究。结果表明:细胞对游离DOX和DOX@HCNPs-PAA-BF在不同时间、不同给药浓度下的摄取量在一定范围内具有依赖性,但在细胞摄取饱和后细胞内药物量便不在增加,表明细胞的容积是有限的。而在低温条件下细胞摄取药物量相较于正常温度下细胞摄取量明显受到抑制,证明细胞摄取具有能量依赖性。内吞抑制剂实验表明DOX@HCNPs-PAA-BF是通过clathrin介导和caveolae介导的内吞和笼形蛋白有被小窝及胞膜窖介导转运进入细胞中的,而DOX主要是依靠能量转运进入细胞的。这表明了HCNPs-PAA-BF能够改变DOX的入胞途径,从而改善其药动参数更好的发挥药理效用。综上所述,本课题所制备的DOX@HCNPs-PAA-BF纳米粒具有肿瘤微环境pH和GSH双重响应释药和靶向递送药物的能力,且安全性良好,在协同Hepatocellular adenoma抗癌提高疗效的同时还可以降低对正常组织的毒副作用。此外,对细胞药物动力学行为进行了研究,为从细胞水平上快速预测和评价药物的疗效和为肿瘤治疗方面开辟了新的思路。