小胶质细胞(Microglia,MG)是维持中枢神经系统稳态的重要细胞之一,在神经系统发育障碍疾病中起着重要的作用。有研究表明,孤独症的发https://www.selleck.cn/products/Rapamycin.html生与MG的炎性激活紊乱密切相关,短链脂肪酸(Short Chain Fatty Acids,SCFAs)作为肠道微生物的代谢产物,能够进入血脑屏障(BBB)调节MG的炎性激活状态,但SCFAs参与MG炎性调节及其对于孤独症MG的调节机制仍未阐明。本研究使用正常人来源的iPSC通过诱导其向中胚层、造血细胞祖细胞及MG分化的路径,建立了 iPSC来源MG的无饲养细胞、无血清的高效制备技术体系,解决了原代MG的取材困难、制备流程复杂的问题。该体系参照MG的系统发生的代谢通路,在诱导的第1-4天以中胚层特征基因HAND1的表达量为指标,确定了 iPSC向中胚层分化的SMAD途径激活因子BMP4和Wnt途径激活剂CHIR99021最适浓度及最佳组合;在诱导的第4-6天通过测定TBXT基因的表达效率,调整bFGF以及VEGF等细胞因子的浓度与milk-derived bioactive peptide配比,实现了向造血祖细胞的高效转化。流式检测可见中胚层细胞标志物KDR,和造血干细胞标志物CD34双阳性细胞群含量约为90%。诱导后第6-40天经SCF、IL-3、TPO、Flt3-Ligand、M-CSF及GM-CSF等细胞因子作用,获得了 MG祖细胞,流式检测结果显示MG祖细胞纯度大于90%;进一步MG祖细胞在IL-34、GM-CSF作用12天后获得了纯度大于95%(96.64%±1.33%)、细胞数量35±4.04倍于初始iPSC的成熟MG。间接免疫荧光及流式鉴定结果均表明,该MG表达IbaI、CX3CR1、P2RY12、CDselleck11b及CD1 1c等MG标志物。经IFN-γ、LPS等分子刺激,所分化的MG具有向M1状态极化的潜能以及吞噬大肠杆菌的吞噬功能。通过对该体系第0、4、6、14及40天的细胞转录组数据进行主成分分析(PCA)及GO分析,显示出明确的iPSC-中胚层-造血祖细胞-MG分化路径。通过与人外周血来源的巨噬细胞、人原代MG的转录组数据的聚类分析结果表明,该体系分化的MG与人原代MG具有较高相似性。进一步,本研究构建了 CHD8基因双位点突变的孤独症患儿来源的iPS细胞株并进一步制备了相应的MG;并观察了肠道微生物代谢产物SCFAs对其炎性应答的影响,发现SCFAs处理后能显著减轻LPS、IFN-γ对MG的炎症激活作用及吞噬活性,降低M1型激活状态对神经元的损伤;进一步的研究发现抑制单羧酸转运蛋白(MCT1/MCT4)的表达可以逆转单链脂肪酸处理对神经元的保护作用,显示MCT4在SCFAs对M1型MG的功能的调节作用中起着重要作用。不同来源转录组数据分析表明,MCT4基因的表达水平在孤独症患者中明显增高,提示MCT4可能是造成孤独症患者与健康人MG接受SCFAs调节能力存在差异的原因之一。总之,本研究建立了无饲养细胞、无血清的人iPSC来源的MG的制备技术体系,所制备的细胞具有均一性强、产率高、其转录组与原代MG具有较高相似性且可以与相应的神经类器官共生的优点,为进一步研究MG与神经元的相互作用提供了一种实验手段;同时本研究探讨了 SCFAs对不同遗传背景的MG的极化能力及免疫调节能力的影响,首次提出了 MCT4基因在肠道菌群代谢物通过调节MG的生物学功能、保护神经元的作用中的关键作用;为神经发育紊乱疾病的病因学研究、寻找疾病客观指标及干预手段提供了一种有效的模型选择。