芦笋是一种雌雄异株多年生的经济作物,嫩茎供食用,质嫩味美,营养丰富,被誉为“蔬菜之王”。它的株型、雌雄性别与其产量和品质有密切关系,研究芦笋株型控制和性别决定的遗传基础与分子机制,对芦笋高产优质育种具有重要意义。2017年国际合作团队完成了芦笋基因组测序组装,预测共有27,656个编码基因,然而绝大多数基因的功能并不清楚。近几年兴起的CRISPR/Cas9基因编辑技术已成为农作物基因功能研究与分子育种的重要工具,但在芦笋中的应用尚未见报道。本研究通过遗传作图对芦笋株高、茎数CH-223191作用、茎粗等株型性状进行QTL定位与候选基因筛选;构建芦笋CRISPR/Cas9高效基因编辑技术,获得芦笋株型相关性状候选基因的功能缺失突变体,开展基因生物学功能分析;同时靶向编辑芦笋性别决定基因SOFF和asp TDF1,获得芦笋性别突变体。主要研究结果如下:(1)获得了2年4个生长季节芦笋栽培品种台南选3号雌株(TN3)和近缘野生种兴安天门冬雄株(XA)及二者种间F_1杂种雌雄2个单株、100株F_2分离个体的株高、茎数、茎粗等表型数据,分析表明这三个性状都呈数量性状的遗传方式,且三者之间特别International Medicine是株高与茎粗之间极显著正相关,相关系数最高达到0.793(P<0.01)。利用dd RAD-seq开发的SNP以及相关功能基因的STS和CAPS标记,构建了一张含有10个连锁群的芦笋高密度遗传图谱,共包含1,218个分子标记,总图距为4,277.34 c M,平均图距为3.51 c M。基于ICIM-ADD方法对芦笋株高、茎粗、茎数等性状进行QTL分析,在2年4个生长季节中共检测出了株型相关性状QTL 17个,LOD值在3.67～10.93之间,可解释6.83～32.87%表型贡献率,其中有4个不同生长季节的株高QTL和3个不同生长季节的茎粗QTL均位于第5号染色体40,131,970～46,821,499间约6.52 Mb区域。该区域有102个预测基因,其selleck PD0325901中Ao SPL14a编码squamosa promoter-binding-like protein 14蛋白,它与水稻理想株型IPA1(Os SPL14)基因高度同源,且在株型显著差异的双亲之间1、3号外显子中存在5个错义SNP,XA表现为矮生细茎性状可能与之有关。Ao SPL14a基因在芦笋嫩茎和拟叶中的相对表达量较高,矮生细茎亲本XA嫩茎中表达量显著下降。结果表明,Ao SPL14a很可能是调控芦笋株高和茎粗的关键基因。(2)基于拟南芥U6基因的保守性,克隆了芦笋2个U6启动子Asp U6P3和Asp U6P6用于驱动sg RNA表达,以此分别构建了携带潮霉素或卡那霉素抗性基因的sg RNA和Cas9共表达载体,一共4套。并以芦笋株高和茎粗候选基因Ao SPL14a为靶基因构建了4个具有卡那霉素抗性的CRISPR/Cas9表达载体,分别通过农杆菌介导遗传转化芦笋品系‘JXT4’胚性愈伤组织。抗性愈伤组织测序分析结果显示,装载Asp U6P3启动子的两个载体3KI1和3KI2愈伤基因编辑率分别为70.00%、78.13%,结果表明芦笋内源U6启动子Asp U6P3具有高效转录活性,可驱动下游sg RNA的表达。抗性愈伤组织诱导分化和再生成苗,转载体3KI1和3KI2的再生植株转基因阳性率分别为46.67%和44.00%,再生植株基因编辑效率分别为64.29%和81.82%,共获得了芦笋Ao SPL14a基因编辑T_0代植株18株,其中,纯合突变体、双等位突变、杂合突变和嵌合突变分别有1、1、3和13株,其中预测基因功能缺失的突变体10株,包括稀有的“三等位”SNP嵌合突变体1株;突变体基因分型结果表明,共有25个突变类型,最常见的是碱基缺失,占71.28%,插入突变和复合突变百分比分别为25.39%和3.33%,插入突变主要是1个碱基插入。突变体表型鉴定结果显示,2株株龄18个月和2株株龄6个月的功能缺失嵌合突变体的株高显著降低,茎粗显著减小;相比野生型对照,2个月苗龄的纯合与双等位突变体株高变矮。基因敲除突变体表型变化结果表明,CRISPR/Cas9介导的Ao SPL14a基因定向突变改变了芦笋株型,进一步证实Ao SPL14a是调节芦笋株型和茎粗的重要功能基因。(3)针对芦笋Y染色体非重组的性别决定区域大部分是半合子的特性,为进一步验证芦笋CRISPR/Cas9基因编辑效率和拓宽应用范围,促进半合子功能基因开发与利用,靶向编辑芦笋Y染色体非重组区性别决定基因SOFF和asp TDF1。构建SOFF和asp TDF1单基因敲除CRISPR/Cas9表达载体各2个,分别转化芦笋XY雄性单株‘X7’胚性愈伤组织,再生植株阳性检测与基因分型结果显示,SOFF和asp TDF1各有1个sg RNA导致靶基因发生编辑,再生植株基因编辑效率分别为36.36%、60.00%。SOFF基因编辑共获得1株纯合突变体和3株嵌合突变体幼苗,共检测出10个突变类型;asp TDF1基因编辑共获得3株嵌合突变体幼苗,共检测出4个突变类型。首次实现了植物Y染色体非重组区域的半合子基因编辑。综上所述,本研究对芦笋株高、茎数、茎粗等株型性状进行了QTL定位与候选基因筛选,建立了芦笋CRISPR/Cas9基因组高效编辑技术,并通过该技术有效地定向突变Ao SPL14a基因改变了芦笋株型,证实了Ao SPL14a基因是调节芦笋株型的重要功能基因,同时获得了芦笋性别决定基因SOFF与asp TDF1的基因编辑材料。研究结果为揭示芦笋株型和性别决定的遗传基础及其分子机制、有效开展芦笋株型和性别控制育种,提供了新技术支撑、基因储备和材料基础。