无核是衡量柑橘果实品质最重要的指标之一。花粉发育异常导致的雄性不育是果实无核性状形成的重要原因。miRNAs在花粉发育中起重要作用,挖掘和验证调控花粉发育的miRNA对柑橘育种Roxadustat体外和品种改良具有重要意义。本研究发现一个调控柑橘花粉发育的csi-miR159a,其在雄蕊中表达量较低。以‘奉节72-1’为材料,利用RLM-RACE技术扩增出csi-miR159a的编码基因CsMIR159A全长,通过遗传转化在番茄和山金柑中超表达csi-miR159a,验证其参与调控种子和果实发育。5’RACE验证csi-miR159a对DUO1的靶切,通过CRISPR/Cas9敲除山金柑DUO1的表型鉴定和授粉实验,确定DUO1是csi-miR159a调控柑橘花粉育性的关键靶基因。基于超表达csi-miR159a和敲除DUO1转基因阳性材料,利用生理生化指标测定、细胞学观察、转录组测序、DNA亲和纯化SCH772984浓度测序(DAP-seq)等方法,解析csi-miR159a通过调节花粉发育调控柑橘种子和果实发育的分子机制。主要研究结果如下:1.csi-miR159a及其靶基因表达模式特征5’RACE和烟草瞬时表达实验验证DUO POLLEN 1(DUO1)、GAMYB、NOZZLE(NZZ)是miR159a靶基因。RT-qPCR分析表明csi-miR159aproperty of traditional Chinese medicine在柑橘不同组织和果实发育不同时期均有表达,在雄蕊中表达量较低,果实发育早期表达量较高。DUO1的表达模式与GAMYB相似,在叶片、雄蕊和雌蕊的表达量相对较高,与csi-miR159a的表达模式相反。NZZ的表达量在叶片中几乎检测不到,但在雄蕊中显著高于其他组织和果实不同发育时期。2.csi-miR159a调控种子和果实发育的功能验证利用RLM-RACE技术扩增出csi-miR159a的编码基因CsMIR159A全长,CsMIR159A不含内含子结构。通过遗传转化将携带miR159a前体的超表达载体转入番茄。在番茄中异源超表达csi-miR159a导致果实无核,且转基因番茄系果实纵径、横径、单果重均显著低于野生型。番茄中异源表达csi-miR159a初步验证其参与调控种子和果实发育。3.柑橘中CRISPR/Cas9体系构建及优化为更好的解析基因功能,在山金柑中建立高效的双靶点CRISPR/Cas9编辑系统。本研究优化了CRISPR/Cas9体系载体构建方法,以DUO1为靶标,研究了不同双元T-DNA载体对CRISPR/Cas9系统编辑效率的影响,结果表明基于p K7WG2D载体的CRISPR/Cas9系统实现山金柑基因组高效编辑,编辑效率达到66.7%。基于优化的CRISPR/Cas9体系,以NZZ为靶标,实现山金柑基因组片段高效敲除。4.miR159a-DUO1模块通过调节花粉发育调控柑橘种子和果实发育山金柑中超表达csi-miR159a(miR159a-OE)和敲除Fh DUO1(Fh DUO1~(CR))均导致柑橘果实无核,且果实纵径、横径、单果重均显著低于野生型。miR159a-OE系和Fh DUO1~(CR)系花粉塌陷、花粉活力和萌发率都显著降低,并且在花粉发育前期淀粉未积累、后期未降解。此外,miR159a-OE系和Fh DUO1~(CR)系小孢子无法完成第一次有丝分裂(PM I)。WT花粉对miR159a-OE系和Fh DUO1~(CR)系进行授粉,结果表明miR159a-DUO1模块调控柑橘花粉育性。花药转录组分析表明,生长素合成基因YUC2和YUC6、生长素响应基因IAA9、淀粉合成基因SS4、糖转运基因STP8和STP14的表达量在miR159a-OE系和Fh DUO1~(CR)系单核花粉败育前期和单核花粉败育时期显著下调。单核花粉败育阶段,miR159a-OE系和Fh DUO1~(CR)系花药中生长素含量显著下降。DAP-seq、酵母单杂和EMSA实验结果表明,DUO1与YUC2、YUC6、IAA9、SS4、STP8和STP14启动子互作。上述结果揭示DUO1通过调控YUC2和YUC6的表达调节生长素的积累,进而调控花粉第一次有丝分裂;另一方面,DUO1通过调控SS4、STP8和STP14的表达来调节花粉中淀粉和糖的积累,进而调控花粉的发育。因此,miR159a-DUO1作为一个中央调控模块,整合生长素代谢、淀粉和糖代谢途径,通过调节柑橘花粉的发育,调控柑橘种子和果实的发育。综上所述,本研究解析了miR159a-DUO1模块通过调节花粉发育调控柑橘种子和果实发育的分子机制,为柑橘育种和改良提供了基因资源和理论依据。