核小体的组装方式包括DNA复制偶联的核小体组装和非复制偶联核小体组装,在这个过程中需要依赖一些特异性的组蛋白分子伴侣的帮助,比如HIR复合物会介导H3.3的沉积,从而在非复制偶联的核小体组装中起主要作用。HIR复合物在物种间高度保守,由三个核心亚基组成:组蛋白调控蛋白(Hira)、泛素核蛋白(Ubn1)和钙调磷酸biological warfare酶结合蛋白(Cabin1)。Hira是这一复合物的支架蛋白,参与了多种染色质调控活动,包括基因转录、异染色质形成、染色质重塑等等。嗜热四膜虫属于纤毛类原生动物,典型特征是含有多倍体大核和二倍体小核两个细胞核,并且两个细胞核有不同的结构和功能,即核的二态性,这种特殊的核发育特征,有利于研究组蛋白分子伴侣在染色质组装中的功能。本研究首次鉴定了四膜虫组蛋白变体H3.3的分子伴侣Hir1,并系统研究了组蛋白调控蛋白Hir1(Histone Regulation 1)在细胞核发育中的功能以及selleck Z-VAD-FMK在核小体组装和染色质结构维持中的作用。获得的主要结果如下:1、HIR1的生物信息学分析首先通过BLAST在四膜虫基因组数据库中鉴定人的Hira的同源基因HIR1。嗜热四膜虫HIR1(TTHERM＿00046490)全长3409 bp,有3个内含子,开放阅读框3078bp,编码1025个氨基酸,Hir1蛋白预测分子量为117 kDa。Hir1包括WD40结构域、B结构域和HirPD0325901采购a结构域,并且在其C端有一个核定位信号序列。RT-PCR结果表明在生长期和饥饿期HIR1的表达量较低,但是在接合生殖4 h特异性高表达。2、Hir1通过核定位信号定位在小核和大核Hir1-3HA在营养生长和有性生殖的各个过程中定位在大核和小核上,并且在小核上具有较强的信号。随着减数分裂进行,Hir1-3HA在小核上的信号逐渐增强,在Anlagen时期定位在功能性的大小核上,而即将凋亡的亲本大核中定位信号消失。Hir1在其C端有预测的核定位信号序列,截短核定位信号序列后,Hir1~(Tr NLS)-3HA定位在胞质中,细胞增殖变慢。在有性生殖时期,突变体细胞不能形成合子核和完成正常的有性生殖过程。免疫共沉淀和质谱分析表明Hir1与异染色质蛋白Hpl2、延伸因子相关蛋白Elp1、DNA损伤修复蛋白Rad51、泛素和蛋白酶体相关蛋白Uba1、DNA错配修复蛋白Msh6等都存在相互作用关系。3、敲减HIR1影响了四膜虫小核的正常发育为了分析HIR1的功能,构建重组质粒并获得敲减突变细胞株和Cd~(2+)诱导的条件干扰突变细胞株。在营养生长期和饥饿期敲减HIR1,小核染色体缺失,面积明显变小且部分细胞小核丢失,细胞增殖速率变慢。在有性生殖时期,HIR1敲减在核选择过程中无法正常选择小核,Anlagen时期出现新大核或新小核丢失的异常细胞,有性生殖过程不能正常完成。敲减HIR1后会影响组蛋白分子伴侣CAF1A、CAF1B、REBL1、ASF1和POB3的表达水平;HIR1抑制组蛋白基因转录,敲减HIR1后H3K4me3水平显著升高。4、Hir1与Asf1结合从而招募组蛋白H3-H4将Hir1的B结构域进行大肠杆菌密码子优化和体外表达,获得带有GST标签的Hir1-B蛋白,利用亲和层析获得GST-Hir1-B与His-Asf1的结合蛋白,然后通过体外pull-down表明Hir1和Asf1之间存在直接的相互作用,推测嗜热四膜虫中Hir1通过与Asf1结合从而招募组蛋白H3-H4。本研究系统地分析了嗜热四膜虫细胞组蛋白分子伴侣Hir1的功能。Hir1在营养生长和有性生殖的过程中定位在大核和小核上。Hir1突变影响小核的正常生长发育和有性生殖过程中的核选择过程,同时调控H3K4me3的水平。Hir1突变影响了基因转录和染色质结构的稳定性。Hir1的功能研究为进一步阐明高等真核生物组蛋白在染色质组装过程中的分子机制提供了新的数据。