第一部分溶酶体生物发生障碍在氟致SD大鼠肝毒性中的作用目的:过量氟化物暴露可引起肝脏损伤,但具体机制需要进一步研究。氟可导致肝细胞自噬流阻滞,而溶酶体生物发生障碍是自噬流阻滞重要原因,此外,转录因子E3(transcription factor E3,TFE3)Post-mortem toxicology是调控溶酶体生物发生的主要调节因子,核易位是其发挥活性的先决条件。因此,本研究拟探索TFE3核易位和溶酶体生物发生障碍在氟化钠(sodium fluoride,Na F)诱导的肝脏毒性中的作用。方法:48只SD大鼠(2月龄,体重为180-250 g)被分为四组:对照组(Na F<1 mg/L)和三个处理组(25、50和100 mg/L Na F),每组12只,各组均通过自由饮水的方式进行染毒,记录各组大鼠的进食、饮水等情况。染毒2个月后,通过酶联免疫吸附试验检测大鼠肝脏丙氨酸氨基转移酶(elevated alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)酶活性。通过western blot法检测自噬相关蛋白LC3-II和p62、溶酶体生物发生和溶酶体降解功能相关蛋白CTSD和LAMP2、凋亡相关蛋白cleaved-PARP、溶酶体生物发生调节因子TFE3蛋白表达。结果:1.酶联免疫吸附试验结果显示,与对照组相比,100 mg/L Na F组ALT和AST活性均显著升高(P<0.05)。2.Western blot结果显示,与对照组相比,Na F组大鼠肝脏中溶酶体生物发生和溶酶体降解功能相关蛋白CTSPUN30119分子量D和LAMP2蛋白表达降低(P<0.05),自噬相关蛋白LC3-II、p62和凋亡相关蛋白cleaved-PARP的蛋白表达增加(P<0.05),溶酶体生物发生调节因子总TFE3和核TFE3蛋白表达均减少(P<0.05)。结论:Na F暴露可损伤大鼠的肝功能,导致肝脏损伤。此外,Na F暴露会引起肝脏组织自噬降解受阻、溶酶体生物发生障碍、溶酶体降解功能损伤和细胞凋亡增加。同时,Na F暴露可导致肝脏组织TFE3核易位减少。综上所述,Na F暴露所致的肝毒性可能与溶酶体生物发生障碍有关。第二部分TFE3介导的溶酶体生物发生障碍在氟致BRL3A细胞毒性中的作用及机制目的:本研究的目的是探究TFE3介导的溶酶体生物发生障碍在Na F致BRL3A细胞毒性中的作用及机制,为阐明Na F导致的肝毒性的的机制提供科学理论基础。方法:构建不同剂量的Na F染毒细胞模型(剂量组0、20、40、60 mg/L Na F)、TFE3过表达干预模型(对照组、60 mg/L Na F组、Ad-null组、Ad-null+60 mg/L Na F组、Ad-TFF3组、Ad-TFE3+60 mg/L Na F组)和雷帕霉素(rapamycin,RAPA)干预模型(对照组、60 mg/L Na F组、RAPA组、RAPA+60mg/L Na F组),染毒24 h后通过CCK-8试剂盒检测细胞存活率,通过酶联免疫吸附试验检测BRL3A细胞ALT和AST酶活性,通过western blot法检测自噬相关蛋白LC3-II和p62、溶酶体生物发生和溶酶体降解功能相关蛋白CTSD和LAMP2、凋亡相关蛋白cleaved-PARP、溶酶体生物发生调节因子TFE3蛋白表达,采用免疫荧光法检测TFE3核易位、溶酶体降解能力和细胞自噬流情况。结果:1.CCK-8结果显示,Na F染毒BRL3A细胞24 h后,与对照组相比,从40 mg/L Na F组开始细胞存活率显著降低,且呈剂量-效应关系(P<0.05)。2.酶联免疫吸附试验结果显示,与对照组相比,60 mg/L Na F组ALT和AST活性均显著升高(P<0.05),提示氟暴露可能会损伤大鼠肝功能。3.Western blot结果显示,不同剂量Na F染毒BRL3A细胞后,与对照组相比,60 mg/L Na F染毒组溶酶体生物发生和溶酶体降解功能相关蛋白CTSD和LAMP2蛋白表达降低(P<0.05),自噬相关蛋白LC3-II、p62GSI-IX和凋亡相关蛋白cleaved-PARP的蛋白表达增加(P<0.05),溶酶体生物发生调节因子总TFE3和核TFE3蛋白表达均减少(P<0.05)。4.免疫荧光结果显示,与对照组相比,随着Na F浓度上升,核TFE3平均荧光强度不断下降(P<0.05);此外,为了进一步确认Na F对大鼠肝细胞自噬降解的影响,用m RFP-GFP-LC3腺病毒处理BRL3A细胞,这样可以区分自噬体和自噬溶酶体。结果表明,与对照组相比,Na F暴露导致了黄点数量的增加和红点数量的减少。DQ-BSA Green实验结果显示,与对照组相比,20、40和60 mg/L Na F组的溶酶体降解能力逐渐下降(P<0.05)。5.为了进一步揭示Na F致肝细胞毒性中TFE3对溶酶体生物发生的调控作用,采用TFE3过表达腺病毒和RAPA处理BRL3A细胞。经TFE3过表达腺病毒和RAPA干预后,western blot实验结果表明,与Na F组相比,BRL3A细胞中RAPA+Na F组和Ad-TFE3+Na F组的LC3-II、LAMP2和CTSD蛋白水平明显增加,p62和cleaved-PARP的蛋白水平明显减少,此外RAPA+Na F组核TFE3蛋白水平明显增加(P<0.05)6.经TFE3过表达腺病毒和RAPA干预后,免疫荧光结果显示,与Na F相比,RAPA+Na F组和Ad-TFE3+Na F组,溶酶体降解能力和核TFE3荧光平均强度均增加。结论:Na F通过抑制TFE3的核易位诱导溶酶体生物发生受损,导致溶酶体降解功能下降,从而导致自噬缺陷和细胞凋亡。Ad-TFE3和RAPA可以通过促进TFE3核易位增强溶酶体生物发生,改善自噬流,进而缓解Na F诱导的肝脏毒性。