弱光是我国北方地区冬季设施草莓生tropical medicine产中面临的主要问题。培育或筛选适宜弱光栽培的品种是解决此问题的重要途径。然而目前我国草莓主栽品种大都引自日本或欧美,本地品种少,品种退化严重,传统的杂交育种耗时长,挑战大。我国野生草莓资源丰富,其中五叶草莓抗寒性、抗病性强,果实香气浓郁,具有极高的研究和利用价值。镁螯合酶催化镁插入到原卟啉IX中,是叶绿素生物合成的重要步骤。该酶由CHLI、CHLD和CHLH三个亚基组成。CHLI亚基是介导催化的ATP酶。因此,本研究采用化学诱变剂ENU诱变的方法,对野生二倍体五叶草莓两个株系的种子进行诱变,通过PF-07321332采购创制五叶草莓M1代突变体库,筛选到一株叶片黄化的突变体p240,其在强光下叶片表现为黄绿色,在弱光下叶色转绿,且弱光下光合能力高于野生型,进一步鉴定了引起p240黄化的候选基因为镁螯合酶I亚基基因Fve CHLI,并研究了该基因的功能。获得的主要结果如下:1.创制了五叶草莓突变体库对课题组前期在陕西省汉中市略阳县收集的五叶草莓(Fragaria pentaphylla Lozinsk.)粉果‘Pink’和白果‘White’株系染色体倍性进行鉴定,流式细胞仪染色体倍性鉴定结果表明,两个株系均为二倍体。通过ENU诱变,构建了两个株系M1代突变体库,共获得突变体200株,其中‘White’株系93株,‘Pink’株系107株。两个株系的突变体在表型类型上未见显著差异,在叶型、叶色、株型和花器官中均观察到明显变异。其中,在叶色变异突变体中,观察到一株黄化突变体p240,其叶片颜色与光照强度有关,在自然光或强光下叶片颜色表现为黄绿色,在弱光下为浅绿色,且在弱光下其光合能力与野生型相比提高了近一倍。因此,本研究进一步对该黄化突变体进行了分析。2.筛选鉴定了p240黄化候选基因对p240突变体和野生型五叶草莓(WT)叶片进行转录组测序,结果表明,p240与WT的差异基因显著富集在叶绿素与卟啉代谢、碳代谢等相关通路。进一步在转录组数据中对以上通路相关基因的SNPs进行分析,查找p240中发生碱基突变而WT与参考基因组一致未发生碱基突变的基因,最后通过蛋白突变位点保守性分析推测镁螯合酶I亚基基因(Magnesium chelatase I subunit,CHLI)和磷酸果糖激酶4基因(ATP-dependent 6-phosphofructokinase 4,PFK4)可能是引起p240黄化的候选基因。其中,CHLI蛋白中第186位谷氨酸突变为赖氨酸,PFK4蛋白中第450位丙氨酸突变为丝氨酸。通过构建两个基因的沉默和敲除载体,分别转化森林草莓‘Ruegen’、‘Hawaii4’及拟南芥‘Col-0’,分别获得了草莓和拟南芥稳定转化植株。转基因株系表型分析显示PFK4与p240黄化表型无关;而获得的CHLI-RNAi株系和基因编辑株系均表现出不同程度的叶片黄化或白化,其中杂合的CHLI编辑株系与p240表型一致,叶片黄化,而纯合的CHLI编辑株系则表现为叶片白化。进一步构建了CHLI过量表达载体,瞬时转化p240叶片,可以部分恢复p240叶片黄化表型。据此推断CHLI是p240黄化的候选基因,并命名为Fp CHLI。3.Fp CHLI蛋白第186位氨基酸突变增强了草莓植株耐弱光,降低Fp CHLI表达更易感染草莓黄单胞菌分析表明,Fp CHLI蛋白第186位谷氨酸(Glu)突变不影响其亚细胞定位,也不影响Fp CHLI与Fp CHLD的互作,但减弱了Fp CHLI自身相互作用,导致ATP酶和镁螯合酶活性降低。这说明第186位Glu在酶功能中起关键作用,通过自身六聚体环的形成影响叶片颜色。对基因编辑的森林草莓‘Ruegen’杂合突变体与WT的叶片代谢物进行检测,结果表明突变体积累了较多的氨基酸,而类黄酮物质含量降低,表明突变体中氮代谢加强,碳代谢减弱。将基因编辑杂合株系及WT置于不同光照强度下,突变体在弱光下(50μmol m~(-2) s~(-1))积累了更多的叶绿素,其在弱光下的光合能力较WT提高了接近2倍,该结果表明杂合编辑株系与pPanobinostat作用240在弱光下的表型一致。进一步分析表明,Fve CHLI的突变可以提高弱光条件下的光合效率,改善草莓植株弱光适应性。CHLI基因及其第186位氨基酸有望成为今后开展草莓弱光适应性分子育种的潜在候选基因和有效位点。另外,对CHLI-RNAi株系和WT接种草莓黄单胞菌YL19,对沉默株系的抗病性进行评价,结果表明沉默株系更易感染草莓黄单胞菌,说明Fve CHLI可能正调控草莓对草莓黄单胞菌的抗性。综上所述,本研究通过建立二倍体五叶草莓突变体库,从中筛选到一株叶片黄化的突变体p240,通过转录组测序SNPs分析结合转基因植株的表型鉴定到引起p240黄化的候选基因为CHLI并对其基因功能进行了分析。研究结果不仅丰富了野生草莓种质,同时为园艺作物中CHLI基因功能研究及草莓抗逆种质的选育提供了理论依据。