研究背景与目的蜱传脑炎(Tick-borne encephalitis,TBE)是蜱传脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus,TBEV)感染引起的中枢神经系统疾病。据世界卫生组织报告,全球每年约12000例TBEV感染病例。TBE主要流行于欧洲、俄罗斯和中国的东北、西北地区。尽管有预防TBE的疫苗,但许多地区疫苗覆盖率不足,TBE发病率正逐步上升。此外,由于气候变化,蜱虫活动范围的扩张及人们旅行活动的增加等因素影响,TBE呈高发病趋势。目前针对TBEV感染尚无特异性的抗病毒治疗药物。因此,急需开发有效的抗TBEV药物。千金藤素(Cepharanthine,Cep)是双苄基异喹啉生物碱成员,具有抗炎、抗氧化、抗寄生虫、抗病毒等多种生物活性。自1950年以来,Cep用于治疗多种疾病,如白细胞减少症、脱发、毒蛇咬伤等。研究表明,Cep抑制核因子NF-κB激活、细胞因子的产生和环氧合酶的表达对病毒的复制和炎症反应起重要作用。利巴韦林(Ribavirin)是一种人工合成的核苷类似物,具有广谱的抗病毒活性,如寨卡病毒、黄热病毒、登革病毒、丙型肝炎病毒等。据报道,利巴韦林还可促进产生一种黏病毒抗性蛋白A(Myxovirus resistance protein A,Mx A)。Mx A是一个约70 KDa的抗病毒蛋白,具有广谱的抗病毒活性。此外,研究报道TBEV可感染多种动物,如金黄色地鼠、昆明小鼠、C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠等。抗病毒药物需在动物模型上进一步验证抗病毒效果,因此建立一个合适的动物感染模型是评估抗病毒药物体内作用效果的重要基础。本课题利用美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准的药物库初步筛选抗TBEV药物。在细胞水平上验证筛选出的千金藤素、利巴韦林的抗TBEV作用。在TBEV感染的BALB/c小鼠体内初步评估千金藤素的抗TBEV效果。本课题旨在为治疗TBE提供潜在的候选药物。研究方法与结果在TBEV感染人肝癌细胞Huh-7中,对FDA药物库中的2580种药物进行高通量筛选,通过免疫荧光检测初步筛选出209种抗TBEV活性的药物。结合药物现有的研究及FDA药物库中的作用描述,选择其中的13种药物在TBEV感染的人肺癌细胞A549中再次验证抗TBEV作用,免疫荧光检测表明仅有千金藤素、利巴韦林、嘌呤霉素盐酸盐、硝唑尼特4种药物对TBEV具有抑制作用。利用MTS法检测4种药物对A549细胞、人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y和非洲绿猴肾细胞Vero的细胞毒性,研究表明4种药物的细胞毒性具有细胞型别依赖性。千金藤素、利巴韦林对A549细胞的细胞毒性较弱,而嘌呤霉素盐酸盐、硝唑尼特对A549的细胞毒性较强。千金藤素通过共处理、预处理、后处理三种方式处理TBEV感染的A549细胞和SH-SY5Y细胞,通过观察细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)发现千金藤素以共处理、预处理方式对TBEV感染的两种细胞具有明显的保护作用。空斑实验显示,与TBEV感染的细胞相比,千金藤素通过共处理、预处理方式显著降低TBEV感染两种细胞后上清中的病毒滴度(P<0.05),呈浓度梯度依赖性降低。实时荧光定量PCR(Quantitative real time-PCR,q RT-PCR)检测显示,与TBEV感染的细胞相比,千金藤素通过共处理、预处理方式显著降低TBEV感染两种细胞内的TBEV RNA水平(P<0.05),呈浓度梯度依赖性降低。与未感染病毒的细胞相比,TBEV感染细胞后C/EBP同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)m RNA的表达显著升高(P<0.05)。与TBEV感染的细胞相比,千金藤素通过共处理、预处理方式显著抑制TBEV感染A549细胞内CHOP m RNA的表达(P<0.05),呈浓度梯度依赖性降低;通过共处理方式显著抑制TBEV感染SH-SY5Y细胞内CHOP m RNA的表达(P<0.05),呈浓度梯度依赖性降低。通过酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)显示,与未感染病毒的细胞相比,TBEV感染细胞后肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)、白细胞介素11(Interleukin 11,IL-11)、白细胞介素1β(Interleukin 1β,IL-1β)的表达升高(P<0.05)。与TBEV感染的细胞相比,千金藤素通过共处理、预处理方式显著降低TBEV感染A549细胞后TNF-α、IL-11、IL-1β的产生(P<0.05);显著降低TBEV感染SH-SY5Y细胞后IL-11的产生(P<0.05)。利巴韦林通过共处理、预处理、后处理三种方式处理TBEV感染的A549细胞和SH-SY5Y细胞,通过观察CPE发现利巴韦林以共处理、后处理方式对TBEV感染的两种细胞具有明显的保护作用。空斑实验显示,与TBEV感染的细胞相比,利巴韦林通过共处理、后处理方式显著降低TBEV感染两种细胞后上清中的病毒滴FG-4592作用度(P<0.05),呈浓度梯度依赖性降低。q RT-PCR检测显示,与TBEV感染的细胞相比,利巴韦林通过共处理、后处理方式显著降低TBEV感染两种细胞内的TBEV RNA水平(P<0.05),呈浓度梯度依赖性降低。与未感染病毒的细胞相比,TBEV感染A549细胞内抗病毒蛋白Mx A m RNA表达升高(P<0.05)。与TBEV感染的细胞相比,利巴韦林通过共处理、后处理方式显著提高TBEV感染A549细胞内抗病毒蛋白Mx A m RNA的表达(P<0.05),呈浓度梯度依赖性升高。ELISA实验显示,与TBEV感染的细胞相比,利巴韦林仅通过后处理方式显著降低TBEV感染A549细胞后TNF-α的产生(P<0.05)。为评估药物在体内的抗TBEV作用,本研究首先通过皮下注射和腹腔注射途径建立TBEV感染BALB/c小鼠模型。通过感染症状、生存率、体重、空斑实验、免疫组织化学、苏木素-伊红染色、相关炎症因子的m RNA表达水平等分析TBEV感染小鼠后的各项指标。TBEV通过两种途径感染小鼠后均出现明显的Long medicines感染症状,如弓背、后肢瘫痪等。TBEV通过皮下注射途径感染BALB/c小鼠,10~3PFU/只(Plaque forming unit,PFU)和10~4PFU/只的攻毒剂量均不能完全致死,小鼠存活率分别为40%、20%;通过腹腔注射途径,两个攻毒剂量均完全致死。TBEV通过两种攻毒途径感染小鼠后,在脑、脾、肾组织中均可检测到TBEV抗原,并引起脑组织的病理改变。TBEV通过皮下注射途径感染小鼠后,空斑实验显示小鼠感染后第5天脾内可检测到TBEV,感染后第7天脑、肾中可检测到TBEV,三种组织中的病毒滴度呈TBEV感染时间依赖性升高。q RT-PCR检测显示,TBEV通过两种途径感染小鼠后,脑、脾、肾组织中TNF-α、干扰素βm RNA的表达水平随TBEV感染时间呈动态变化。结果表明TBEV通过皮下注射和腹腔注射途径均在小鼠体内成功建立感染。在TBEV感染的BALB/c小鼠体内初步评估千金藤素对TBEV感染小鼠的保护作用。与TBEV感染组小鼠相比,提前给药组小鼠存活率达66.7%,并显著抑制脑、脾、肾中TBEV抗原表达,减轻脑组织的病理损伤。研究表明GNE-140分子量千金藤素通过提前给药方式对TBEV感染的小鼠具有明显的保护作用。综上所述,本研究在细胞水平上证实了千金藤素、利巴韦林具有抗TBEV作用。在动物水平上初步表明千金藤素通过提前给药方式对TBEV感染的BALB/c小鼠具有明显的保护作用。在今后的研究中将加强药物的作用机理研究,为治疗TBE提供潜在的候选药物。