背景原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC,以下简称肝癌)是全世界最严重的的恶性肿瘤之一,具有发病率高、死亡率高、难以根治、预后差等特点,严重危害人类健康。化疗作为传统肿瘤治疗方法,在抑制肿瘤生长,延长患者生存时间上应用广泛。然而,单一化疗存在毒副作用大,易诱导肿瘤多药耐药等不足,影响治疗效果。局部给药、纳米载药系统是药物治疗的发展趋势,同时多模式协同抗肿瘤疗法也有利于减轻药物毒性,增强疗效。雷公藤红素(CEL)是中药雷公藤中最主要的抗肿瘤活性单体成分之一。现代药理研究表明,CEL具有广谱、高效的抗肿瘤活性,对多种肿瘤细胞具有良好的抑制作用,同时可逆转机体多药耐药。然而其水溶性差,溶出低,生物利用度低及一定肝肾毒性影响了其临床转化。纳米载药系统、局部给药等技术手段,有助于提高雷公藤红素生物利用度,增效减毒。目的本研究拟使用CEL作为模型药物,高分子聚合物聚多巴胺(PDA)作为光热剂,结合纳米技术,设计两类具有光热-化疗协同作用的纳米给药体系,以期克服CEL的不足,弥补单一模式的缺陷,起到增效减毒的作用。方法(1)制备及表征:首先制备了一种无载体纳米给药体系,以泊洛沙姆188为稳定剂,采用沉淀法制备雷公藤红素自组装纳米粒(CEL-NS),通过氧化聚合法表面修饰聚多巴胺(PDA),同时单因素考察了修饰量,得到光热修饰的载药纳米粒子(PDA@CEL-NS)。通过纳米粒径仪、扫描电子显微镜、X-射线衍射仪、红外光谱仪对其粒径大小、形貌特征、晶体特征、红外图谱等进行表征,对其储存稳定性及不同生理介质稳定性进行了考察,进行了体外药物释放实验以及体外光热升温实验评价其释放性能及体外光热升温性能。之后,制备了以金属有机骨架材料(MOFs)为载体的纳米给药体系。首先通过单因素考察及正交实验设计对UIO-66、ZIF-8与MIL-101(Fe)三种MOFs的制备工艺进行优选并比较,从三种常见Th1 immune response纳米MOFs中筛选出最宜的一种作为药物载体,经过吸附法负载CEL,氧化聚合法表面修饰PDA,单因素考察载药工艺及PDA修饰比例,构建载药量高、光热性能好的光热修饰载药MOFs(PDA@MOFs-CEL),对其粒径大小、形貌特征、晶体结构、热重变化、载药量、体外释放及体外光热性能等理化性质进行表征;此外,制备以泊洛沙姆407、泊洛沙姆188和HPMC为基质的温敏凝胶,纳米粒子分散其中制得金属有机骨架/温敏凝胶复合体系(PDA@MOFs-CEL-GEL),对其胶凝温度、黏度变化及体外溶蚀情况进行考察。(2)体外细胞学评价:以HepG2肝癌细胞为模型,采用CCK-8法评价纳米粒子生物安全性、细胞毒性及光热联合化疗细胞药效,DAPI染色法观察纳米粒子对细胞核形态的影响,细胞划痕损伤修复实验探讨纳米粒子对细胞迁移的影响,流式细胞仪测定纳米粒子对细胞凋亡的影响。(3)体内药效评价:建立H22肝癌荷瘤小鼠模型,直接观察皮下注射温敏凝胶的滞留情况;通过红外热像仪评价纳米粒子在荷瘤小鼠体内的光热升温效果及瘤内滞留情况;近红外荧光活体成像法监测纳米粒子在荷瘤小鼠体内的生物分布及滞留时间;通过瘤内注射给药,监测瘤体积及瘤重评价光热-化疗协同抗肿瘤药效;取小鼠血清,谷丙/谷草转氨酶检测试剂盒初步评估纳米粒子的肝毒性;药效试验后取小鼠主要脏器进行HE染色,组织病理学评价纳米粒子体内系统毒性。结果(1)体外表征结果表明,制备的PDA@CEL-NS为类球形纳米粒子的水分散溶液,粒径大小189.67±2.08 nm,分布均匀,载药量高达60.33±1.09%。其在考察期间具有较好的稳定性,体外释放表明PDA@CEL-NS可显著增强药物溶出,累计释放率可达60%,体外光热升温研究表明其具有浓度依赖性升温,光热稳定性较好。体外细胞学评价表明,PDA@CEL-NS可浓度依赖性抑制肿瘤细胞增殖,IC50(以CEL计)为2.238 μg/mL,药效强于游离药物(ILBH589临床试验C50值为2.609μg/mL),经808 nm激光处理后,PDA@CEL-NS的肿瘤细胞抑制效果显著增强;DAPI染色实验证实纳米粒子可影响细胞核形态,具有凋亡诱导性,细胞划痕损伤实验表明纳米粒子可抑制细胞迁移,细胞凋亡实验表明诱导细胞凋亡是其细胞毒性机制之一。体内研究证实PDA@CEL-NS在小鼠体内具有较好的光热升温效果,升温效率随着时间推移而降低,表明了纳米粒子被逐步代谢,同时体内药物分布显示纳米粒子肿瘤滞留效果优于原药,药物在体内主要分布于肿瘤组织,在其它主要脏器分布较少,体现了纳米制剂和瘤内给药的优越性。抗肿瘤药效结果表明,PDA@CEL-NPLX3397供应商S外加激光组抑瘤率可达92%,是单独PDA@CEL-NS组的1.57倍,是游离雷公藤红素药物的2.73倍,表现出纳米制剂良好的“增效”作用以及光热-化疗双模式协同抗肿瘤的优越性。最后小鼠血清肝毒性生化指标测定及组织病理学考察,证明了纳米制剂对小鼠主要脏器基本无毒副作用,且相较于原药具有一定肝保护作用。(2)制备了三种常见MOFs纳米载体UIO-66、ZIF-8、MIL-101(Fe),通过粒径大小比较及制备难易比较,筛选出ZIF-8作为纳米载体,制备CEL纳米给药体系,进而PDA表面修饰制备载药量高、光热性能好的PDA@ZIF-8-CEL纳米粒子。制备的PDA@ZIF-8-CEL纳米粒子的粒径305.8±8.4 nm,形貌为类球形,形状规则,结晶度好,载药量约为23.47±0.26%。体外释放研究证实其具有良好的缓释效果,且经808 nm激光处理后,体外光热升温性能好,光热稳定性高。制备了以泊洛沙姆和HPMC为基质的温敏凝胶,胶凝温度29℃,将纳米粒子分散于空白凝胶中即可得PDA@ZIF-8-CEL温敏凝胶复合体系(PDA@ZIF-8-CEL-GEL),胶凝温度基本未改变。体外细胞实验评价了PDA@ZIF-8-CEL纳米粒子细胞毒性。实验剂量下,ZIF-8与PDA@ZIF-8具有良好的生物安全性,PDA@ZIF-8-CEL对HepG2细胞半数抑制浓度为2.078 μg/mL,显著优于游离药物,PDA@ZIF-8-CEL加近红外激光处理可进一步增强抗肿瘤效果,体现了良好的光热协同治疗作用。此外,DAPI染色实验、细胞划痕实验及细胞凋亡实验证实PDA@ZIF-8-CEL可通过诱导细胞凋亡诱导细胞核破裂变形及抑制细胞迁移殖。动物体内研究表明,瘤内注射温敏凝胶后,具有良好的瘤内滞留效果,通过直观观察、瘤内光热升温、体内药物分布实验均可得到验证,纳米粒子主要分布于肿瘤组织,在其他主要脏器分布较少,在肿瘤组织滞留时间长,注射后第5天经激光处理,仍可升温至50℃以上。药效试验证实,PDA@ZIF-8-CEL-GEL外加激光组抑瘤作用显著优于其他组,治疗结束后,有两只小鼠肿瘤完全消失,抑瘤率高达97%,显示出温敏凝胶复合体系良好的促进光热-化疗协同作用发挥的功效。取药效试验后小鼠血清,测定肝毒性相关生化指标,结果显示纳米粒子可显著降低血清中谷丙转氨酶含量,表明纳米粒子相较于原药对肝损伤情况有所改善,具有“减毒”作用。组织病理学研究也证实了纳米给药体系对小鼠主要脏器基本无毒副作用。结论本文基于中药活性单体雷公藤红素,结合纳米技术,构建了有无载体两类纳米给药体系,用于光热-化疗双模式协同抗肿瘤。首先构建了聚多巴胺修饰雷公藤红素自组装纳米给药体系,可增强药物溶出,克服了单一模式的不足,体现了光热治疗与化疗双模式抗肿瘤的相辅相成;其次,基于瘤内长效滞留考虑,设计了金属有机骨架/温敏凝胶复合纳米给药体系,将纳米粒子与温敏凝胶有机结合,实现了局部长效滞留,促进了光热-化疗协同作用的发挥,实现了增效减毒的目的。通过纳米技术,将光热治疗、化疗双模式结合抗肿瘤,为肿瘤治疗提供新思路,为雷公藤红素抗肿瘤应用提供一定基础。