背景:随着社会的高速发展和各种高压事件的频发,抑郁症逐渐成为全球范围内最为普遍的精神障碍类疾病。抑郁症以长期的情绪低落、快感缺失和行为绝望为主要特征,但目前临床使用的一线抗抑郁药物治疗效果不佳,患者停药后易复发,这些现状提示抑郁症具有多病因机制的显著特点。因此,目前亟需更全面地阐明抑郁症的病理机制,以寻找治疗抑郁症的新靶点,并针对性地开发更优化的诊断和治疗策略。近年研究表明,神经元可塑性失调在抑郁症的发生发展中可能起着重要作用。慢性、持续的压力应激往往导致大脑出现适应性异常,神经元发生结构和功能可塑性损伤,从而影响正常的神经放电、神经内分泌等活动,这可能是促进抑郁、焦虑等情绪障碍发生的重要诱因,但具体机制不清。细胞内酸碱平衡是细胞维持功能活动稳态的重要特征之一,但截至目前止,神经元细胞内酸碱稳态失衡在抑郁症发病中的作用及机制尚不清楚。Na+/H+交换体(Na+/H+exchanger,NHE)属于高度进化保守的转运蛋白家族,可将细胞内H+与胞外Na+进行电中性交换,调控细胞内pH值(intracellular pH,pHi)的动态平衡。其中,NHE1是中枢神经系统中表达最丰富的亚型,尤其在皮质、海马和小脑中高表达,是哺乳动物神经元细胞内酸碱稳态的主要调节者,但其在突触可塑性调节中的作用,及其异常表达是否参与抑郁症的发病过程,目前尚未可知。在此研究背景下,我们拟构建慢性不可预知温和应激(Chronic Unpredicted Mild Stress,CUMS)诱导的抑郁动物模型,并采用蛋白质组学、膜片钳电生理、行为学检测、化学遗传学、病毒学和转基因鼠结合等多种实验技术与方法,探究压力应激作用下,NHE1是否通过调节神经元突触可塑性参与抑郁症的发生发展,及其发挥作用的具体分子机制。方法:(1)在体CUMS建模:将雄性Wistar大鼠(120-140 g)随机分为Control(空白对照组,Ctrl)组和CUMS组,给予CUMS组大鼠5周的慢性不可预知温和应激。造模结束后,对两组大鼠进行行为学测试以评估大鼠抑郁样和焦虑样行为,包括蔗糖偏好实验、强迫游泳实验、旷场实验和高架十字迷宫实验;采用H+荧光探针检测神经元细胞内pH值水平;采用免疫荧光、高尔基染色、透射电镜检测神经元结构可塑性如树突棘、突触的形态数目变化等;采用脑片膜片钳技术检测神经元功能性放电活动。对Control组大鼠和行为学测试中表现出抑郁样行为的CUMS组大鼠海马组织样本进行Label-free定量蛋白质组学检测,通过生物信息学分析寻找与调节细胞内pH值有关的差异性表达蛋白质。(2)敲减NHE1的腺相关病毒脑内注射建模:构建特异性敲减兴奋性神经元中NHE1的腺相关病毒,利用脑立体定位仪注射于大鼠的双侧海马CA1(Cornu Ammonis 1)区,病毒感染2-3周后进行蔗糖偏好实验、强迫游泳实验等行为学检测,若无显著的抑郁样行为,则给予大鼠2周的慢性不可预知温和应激刺激;通过Western blot技术、免疫荧光、转盘式共聚焦、高尔基染色、全细胞膜片钳技术和电子显微镜分别观察NHE1蛋白的表达水平、细胞定位、细胞内pH值以及神经元结构和放电活动的改变。采用全转录组学测序和qPCR技术验证NHE1的mRNA表达水平;通过富集分析寻找调控翻译后修饰相关的蛋白质,进一步利用定量蛋白组学结果和生物信息学分析寻找与调控NHE1蛋白表达水平相关的差异性表达蛋白质。(3)离体实验建模:培养原代大鼠海马神经元,构建皮质LEE011体内酮(Corticosterone,CORT)诱导的细胞应激模型,验证应激刺激作用下NHE1蛋白的降解途径:采用溶酶体抑制剂氯喹阻断溶酶体降解通路,采用蛋白酶体抑制剂MG132阻断蛋白酶体降解通路;利用免疫荧光技术观察NHE1和CUL4A(Cullin4A)在神经元中的定位;采用免疫沉淀技术验证应激刺激作用下NHE1的泛素化水平。(4)构建过表达CUL4A的腺相关病毒,并通过脑立体定位仪定位注射于Thy1-Cre小鼠双侧海马CA1区,病毒感染2-3周后,对各组动物进行蔗糖偏好实验和强迫游泳实验等行为学测试;采用H+荧光探针和转盘式共聚焦检测小鼠海马CA1区神经元内pH值变化;通过Western blot技术检测CUL4A和NHE1的蛋白表达水平;使用膜片钳技术检测神经元自发性放电及诱发的动作电位变化。(5)基于化学遗传学技术,构建AAV-DIO-hM4Di-mCheery病毒,通过脑立体定位仪定点注射于Thy1-Cre小鼠海马CA1区;构建AAV-CaMKII-hM4Di-mCheery病毒注射于正常大鼠的海马CA1区,病毒感染2-3周后,对动物进行腹腔注射生理盐水或者CNO(clozapine-N-oxide)处理,通过蔗糖偏好实验和强迫游泳实验检测行为学改变;采用脑片膜片钳技术检测CNO给药前后神经元的兴奋性变化。结果:(1)与Control组比较,CUMS组大鼠在蔗糖偏好实验中对糖水的消耗百分比明显降低;在强迫游泳实验中其保持不动、相对静止的时间显著增多;在旷场实验中运动的总距离没有明显差异,但与Control组比较,CUMS组大鼠在中央格停留的时间减少;在高架十字迷宫实验中,与Control组比较,CUMS组点击此处大鼠进出开放臂的次数以及停留在开放臂的总时间均明显减少。与Control组比较,CUMS组大鼠海马CA1区神经元内pH值显著降低;CUMS组大鼠海马CA1区神经元的树突复杂性、树突棘密度和突触数量均有一定程度的降低;与Control组比较,CUMS组大鼠海马CA1区神经元自发性兴奋性突触后电流和微小兴奋性突触后电流减弱。以上结果提示5周的慢性不可预知温和应激可诱导大鼠表现出抑郁样行为,降低神经元内pH值水平并导致海马神经元结构和功能可塑性异常。(2)蛋白质组学结果显示,多种蛋白质在抑郁样大鼠海马CA1区存在差异性表达,其中NHE1蛋白表达明显减少,提示NHE1可能是参与抑郁症发病中神经元胞内pH值降低和可塑性损伤的关键分子。(3)行为学检测结果显示,相比于注射对照病毒组,敲减正常大鼠海马CA1区NHE1的蛋白表达后,动物的行为学检测结果无显著性变化,但给予这组大鼠仅2周的CUMS刺激,就足以诱导明显的抑郁样行为,包括在蔗糖偏好实验中饮用糖水的百分比减少,在强迫游泳实验中呈现静止状态的时间显著增加等。以上结果提示,相比于注射对照病毒组,敲减大鼠海马CA1区NHE1蛋白表达使大鼠在受到压力应激刺激后更容易表现出抑郁样行为,对应激刺激的易感性增加。(4)QPCR结果显示,Control组和CUMS组间NHE1的mRNA表达水平无统计学意义,提示NHE1蛋白水平下调可能是由于转录后或翻译后调控所致。COG(Cluster oforthologous group)富集分析显示,抑郁大鼠海马CA1区呈差异性表达的蛋白质主要富集在蛋白质翻译后修饰途径。在富集于翻译后修饰通路的差异性蛋白质中,CUL4A作为可通过泛素化降解蛋白质的E3泛素连接酶家族重要成员,与Control组比较,其在CUMS组表达水平明显增高。Western blot技术检测发现,经蛋白酶体抑制剂MG132处理后,可明显逆转CORT诱导的NHE1表达水平的下调,说明应激刺激作用下NHE1蛋白水平的下调可能与蛋白酶体降解途径有关。免疫荧光结果显示CUL4A和NHE1在内质网上存在共定位现象。免疫沉淀结果表明,随着CORT作用时间增加Collagen biology & diseases of collagen,培养的原代神经元中NHE1泛素化水平明显升高。这些结果提示CUL4A可能靶向NHE1的泛素化修饰,并促进其通过蛋白酶体途径降解。(5)在Thy1-Cre小鼠海马CA1区锥体神经元中过表达CUL4A,给予小鼠2周的CUMS刺激,即可诱导其产生明显的抑郁样行为。同时发现,相比于注射对照病毒组,过表达CUL4A的小鼠CA1区谷氨酸合成酶活性下降,锥体神经元内pH值降低,神经元自发性放电及诱发的动作电位明显减少,并伴随NHE1蛋白表达水平降低。(6)脑片膜片钳全细胞记录结果发现,在新鲜的脑切片灌流液中加入CNO后,表达hM4Di的Thy1-Cre小鼠海马椎体神经元产生动作电位的诱发电流阈值增高,神经元兴奋性降低;相比于CNO给药前,在相同的注入电流诱发条件下,表达hM4Di的大鼠兴奋性神经元动作电位频率降低。行为学检测结果发现,在锥体神经元中特异性表达hM4Di的Thy1-Cre小鼠中,相比于生理盐水注射组,腹腔注射CNO组小鼠在在强迫游泳实验和悬尾实验中的静止时间均增多。同样,在兴奋性神经元中特异性表达hM4Di的大鼠中,相比于腹腔注射生理盐水组,腹腔注射CNO的大鼠在强迫游泳实验中静止不动时间增多,在蔗糖偏好实验中糖水消耗百分比减少,表现出抑郁样行为。结论:慢性压力应激可导致大鼠海马CA1区E3泛素连接酶CUL4A表达增加,CUL4A可能通过泛素化修饰NHE1使其降解增加,导致神经元内H+排出减少、pH值降低,细胞内酸碱稳态失衡,继而导致海马CA1区锥体神经元突触可塑性发生失调,突触传递效能减弱,神经元兴奋性降低,并最终促进动物产生抑郁样行为。本研究结果完善了压力应激刺激导致抑郁症发病的神经可塑性损伤机制,为发现和筛选新型抗抑郁药和抗抑郁治疗新策略提供潜在靶点和科学依据。