漆酶是一种蓝色含铜多酚氧化酶,属于蓝色多铜氧化酶家族,一般是以单体、二聚体或四聚体糖蛋白的形式存在于自然界中。多年来,针对于漆酶的研究经久不衰,主要涉及生物、化学、环境等众多领域。此外,漆酶在环保、纺织、印染、食品、化学合成等方面具有广泛的应用前景,引起了人们的广泛关注及极大的兴趣。随着研究的深入,人们发现有些漆酶与典型的蓝漆酶不同,不含四个铜离子,被称为“白polymers and biocompatibility漆酶”或“黄漆酶”,并表现出与蓝漆酶不同且独特的性质。由于它们能够在没有任何介质的情况下氧化非酚类底物,因此被认为是比蓝漆酶更好的生物催化剂。本研究通过对基因组数据的挖掘,从微生物中成功克隆出一种新型细菌白漆酶,并在大肠杆菌中异源表达,利用多种生物信息学工具对酶序列和结构进行生物信息学分析并考察了重组酶的理化性质。随后通过酶固定化、深共熔溶剂体系的加入等措施解决了该酶在具体应用上的局限性并将其用于抗生素的降解。此外,通过同源建模、酶与底物分子对接模拟过程了解酶与底物之间的相互作用方式,并在此基础上通过构建高活力的突变体,拓宽了可作用的底物范围。本文主要围绕挖酶、改酶以及用酶这三个方面展开相关研究。主要的研究内容和结果如下:(1)通过NCBI数据库以及生物信息学分析,从本实验室保藏的细菌Methylobacterium extorquens中成功克隆表达出细菌白漆酶Melac13220。利用多种生物信息学工具对酶序列和结构进行分析,并表征了重组酶的酶学性质。经同源序列分析发现,该酶与其他多铜氧化酶的序列相似性仅为20-32%。通过序列进化树分析进一步证明,该酶属于独特分支的未被报道的非蓝漆酶。根据其所含金属离子成分,可归为“白漆酶”。通过酶学性质表征发现,该酶表现出与典型蓝色漆酶不同的性质,纯化后的Melac13220呈现出无色状态,T1铜对应的610nm和T3双核铜对应的330 nm附近未发现有吸收峰,而在260 nm处存在吸收峰。该酶的最适温度为65℃,在40°C和50°C温度下能够保持良好的稳定性,半衰期分别为50 h和9 h;Melac13220的最适p H值为1.5,为在酸性环境中具有高活性的嗜酸性酶。Cu~(2+)和Co~(2+)可使酶活力略有提高,在Fe~(2+)存在时,可使酶活力提高5倍以上,在一定程度上也起到稳定酶的作用。与大多数漆酶不同,Melac13220可以在没有任何氧化还原介体存在下,对刚果红和靛蓝胭脂红染料有较好的脱色效果。(2)Melac13220在应用中有一定的局限性,如稳定性较低,易受外界因素影响等。因此采用在Melac13220的氨基端、羧基端以及双端引入一段多肽链序列LCTPSR序列,经FGE催化生成醛基再通过Schiff碱反应共价结合到带有氨基基团的磁性纳米粒子上,实现酶与磁性纳米粒子的特异性定点共价结合。随后对Melac13220的固定化条件进行优化,与通过物理包埋和化学交联等固定化方法获得的Melac13220固定化酶相比较发现,位点特异性共价固定化法具有最高的固定化效率和活力恢复率,对经此方法固定化后的Melac13220进行酶性质表征研究,发现固定化Melac13220的最适温度为80°C,与游离态相比提高了15°C,此外固定化后的Melac13220对一些有机溶剂表现出较为显著的耐受性。DSC结果表明酶的熔化温度从游离态时的57°C提高至固定化后的79°C。此外,经固定化过程提高了Melac13220对染料的脱色效果,可使刚果红在10 h内完全脱色。(3)抗生素在医疗领域发挥着不可或缺的作用。然而,抗生素残留造成的生态环境失衡已成为一个亟待解决的问题。在众多的抗生素中,β-内酰胺类抗生素氨苄青霉素因其优异的性价比而具有更广泛的应用范围,其环境残留量高,因此造成的环境问题也更为突出。在无氧化还原介体存在下,游离Melac13220和固定化Si O_2-Fe_3O_4-Melac13220-CQ表现出对β-内酰胺类抗生素氨苄青霉素的氧化降解能力,其中Si O_2-Fe_3O_4-Melac13220-CQ的降解效率更高。经推断发现,Melac13220对氨苄青霉素的降解主要包括羟基化、脱羧以及β-内酰胺环的开环等过程。(4)为了提高Melac13220的稳定性,将由一个氢键受体(HBA)和一个氢键供体(HBD)组成的天然深共熔溶剂作为一种新型的绿色溶剂添加到Melac13220体系中,尝试提高酶的稳定性。使用丙三醇-甜菜碱(GBDES)、丙三醇-氯化胆碱(GCDES)、乳酸-甜菜碱(LBDES)、乳酸-氯化胆碱(LCDES)、木糖醇-甜菜碱(XBDES)、木糖醇-氯化胆碱(XCDES)共六种天然深共熔溶剂,探讨对酶活力和稳定性的影响。研究结果表明,不同浓度的GBDES、LBDES、LCDES、XBDES、XCDES均表现出能够增强Melac13220酶活力GSK126的作用,而GCDES对Melac13220具有轻微的抑制作用。深共熔溶剂(DES)可诱导酶的构象变化,促进蛋白质折叠,进而影响酶活力和热稳定性。乳酸基和甜菜碱基DESs具有较高的活化效果,这可能是由确认细节于在DES存在时除了氢键外,还形成了自氢键,可显著提高Melac13220的酶活力。(5)为了进一步提高Melac13220的催化反应活力和拓宽底物适用性,通过计算机辅助的同源建模和酶与底物分子的对接分析,构建突变体V212L、R248S、K394M。通过酶活力筛选发现,与野生型相比,三个突变体酶活力均有不同程度的提高,突变体的底物谱也更广。将酶与底物结合口袋处的碱性氨基酸突变为非极性的蛋氨酸后,酶的催化反应能力有较大改变,说明结合口袋处氨基酸结构在酶的催化效率和底物特异性方面起着重要作用。