鸡传染性鼻炎(Infectious coryza,IC)是由副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum,Apg)引起的一种鸡的急性呼吸道传染病,该病会导致产蛋鸡产蛋量下降、育成鸡营养不良等,严重危害鸡群的生产性能。细胞致死膨胀毒素(Cytolethal Distengding Toxins,CDT)是一种细菌基因毒素,能够导致哺乳动物细胞双链DNA断裂、靶细胞分裂周期停滞甚至死亡,在多种革兰氏阴性菌感染中发挥重要作用。但是,目前副鸡禽杆菌CDT(ApCDT)的致病机理还不明确。本研究利用原核系统表达了ApCDT的三个亚Tamoxifen溶解度基CdtA、CdtB和CdtC,用纯化后的重组蛋白重构了完整的ApCDT,并对ApCDT的细胞毒性进行分析;此外,本研究对ApCDT各亚基的抗原位点进行分析,利用动物试验分析了 ApCDT的免疫原性。为进一步验证ApCDT的毒性作用,本研究通过自杀质粒对ApCDT定向敲除,构建ApCDT基因缺失株,比较缺失株和亲本株间体外毒性差异。1.副鸡禽杆菌CDT的细胞毒性、免疫原性分析本研究首先使用SignalI-3L和Predsi在线软件对ApCDT各亚基信号肽进行预测,根据预测结果,设计特异性引物扩增去除了信号肽的各亚基,并将各亚基克隆至pET32a原核表达载体上,以可溶性表达形式纯化了 ApCDT的三个亚基。NCBI对ApCDT各亚基功能结构域的预测结果显示CdtB具有核酸酶结构域,本研究通过体外DNA消化试验验证了重组蛋白rCdtB的核酸酶活性。本研究以不同剂量的ApCDT处理DF-1和HD11细胞6～24 h,瑞氏-姬姆萨染色后发现细胞出现显著膨胀、细胞核破碎甚至死亡的现象,且这些现象具有剂量及处理时间依赖性;间接免疫荧光试验和Western blot试验表明ApCDT可引起细胞中H2AX磷酸化水平升高,这说明ApCDT可诱导细胞DNA损伤。流式细胞术对细胞周期的分析结果显示,与MOCK组相比,ApCDT能够引起细胞出现G2/M期阻滞。TUNEL法检测到与MOCK组相比,ApCDT导致DF-1细胞凋亡;Western blot和RT-qPCR结果显示促凋亡因子BAX表达量上调,而抑凋亡因子Bcl2表达量下调,进一步证实ApCDT可诱导DF-1细胞发生凋亡。综上表明ApCDT对DF-1和HD11宿主细胞具有细胞毒性。MegAlign对CDT基因的同源性比对结果显示,CDT基因在在不同细菌间保守性较低,而在副鸡禽杆菌菌株间保守性较高;B细胞抗原表位预测结果显示,CdtA、CdtB及CdtC分别有5个、8个及6个优势抗原表位;上述结果表明ApCDT保守性较高,具有优势抗原表位,可考虑将其用于亚单位疫苗的研究。本研究将ApCDT以50μg(低剂量)和100 μg(高剂量)的剂量分别对21日龄试验鸡进行免疫,在免疫后28 d使用2022JS04菌株对试验鸡进行攻毒保护试验。间接ELISA试验结果显示高剂量免疫组抗体水平高于低剂量免疫组。攻毒后第3天未免疫攻毒组发病率为58.33%,低剂量免疫攻毒组为50%,高剂量免疫攻毒组仅为40%。攻毒后第7天STING抑制剂起,低剂量及高剂量免疫攻毒组的临床症状评分和排菌量测定结果均低于未免疫组。病理剖检结果显示,仅未免疫组试验鸡在攻毒后出现鸡传染性鼻炎的典型病变。综上所述,ApCDT免疫后可对试验鸡产medicine management生一定的保护效果,其有希望作为副鸡禽杆菌亚单位疫苗的候选蛋白。2.副鸡禽杆菌CDT基因缺失株的构建本研究利用自杀质粒构建CDT基因全长敲除的缺失株,并对缺失株和亲本株的生物学特性及细胞毒性进行比较。首先将pk18mocsacB自杀质粒中原有的卡那霉素抗性表达盒替换为氯霉素抗性表达盒,构建重组质粒pk18-cm。然后利用特异性扩增引扩增获得CDT基因上游同源臂、下游同源臂及卡那霉素抗性表达盒,并通过Overlap PCR连接上述三个片段,扩增获得UKD融合片段。利用酶切连接方式将UKD片段连入pk18-cm质粒,获得重组质粒pk18-cm-UKD。采用自然转化法将pk18-cm-UKD转入JS80副鸡禽杆菌,在卡那抗性平板中传2代筛选获得单交换,再经蔗糖平板负向筛选获得双交换即JS80ΔCDT缺失株。PCR和测序鉴定的结果显示,卡那霉素抗性表达盒成功替换CDT基因,说明JS80ΔCDT缺失株构建成功。本研究对JS80ΔCDT缺失株进行多次传代验证其稳定性,结果表明连续传10代后缺失株仍保持良好的遗传稳定性。此外,JS80ΔCDT缺失株和JS80亲本株生物学特性的测定结果显示,JS80ΔCDT缺失株的生长性能与JS80亲本株无显著差异;但JS80ΔCDT缺失株与DF-1细胞共孵育60 min后,其对细胞黏附能力显著低于JS80亲本株。使用JS80ΔCDT缺失株和JS80亲本株的培养上清处理DF-1细胞,发现经JS80亲本株上清处理72 h后的细胞出现显著膨胀、细胞核崩解甚至死亡的现象,而JS80ΔCDT缺失株培养上清处理后的细胞形态则无显著变化,这表明CDT基因编码形成的毒素是导致宿主细胞膨胀甚至死亡的因素。通过动物攻毒试验发现与JS80亲本株相比,JS80ΔCDT缺失株攻毒组试验鸡转归速度较快,并且试验鸡的病理变化较轻,这说明CDT基因的缺失可降低毒株致病力。综上,本研究首次利用自杀质粒构建副鸡禽杆菌缺失株,确定CDT是Apg的毒力因子之一,可引起宿主细胞出现细胞病变,导致宿主细胞周期阻滞和凋亡。CDT基因缺失后将影响菌株致病力。同时,ApCDT蛋白具有良好的免疫原性,可提供一定的免疫保护力,表明CDT可作为Apg亚单位疫苗的候选抗原。