研究背景病原微生物是威胁人类健康和造成社会公共卫生事件的主要因素之一,如何在早期发现并鉴定病原微生物对控制疫情、降低社会影响至关重要。传统的病原微生物检测方法(如病原体培养法、免疫学检测法和分子生物学检测法)均存在耗时较长、依赖专业实验室和专业人员、需要复杂精密的仪器设备等局限。电化学生物传感器技术因其具备响应迅速、灵敏度高、信号读取简单、易小型化和可集成化等优点,在病原微生物即时检测方面优势明显,受到了广泛关注。近年来,CRISPR核酸检测技术在病原体检测领域中展现出了巨大的潜力。研究人员充分利用了CRISPR检测技术的简单、快速、灵敏、特异和通用等优势,将CRISPR-Cas核酸检测技术与电化学生物传感器相结合,掀起了基于CRISPR电化学生物传感器技术的研究热潮。但目前CRISPR电化学生物传感器技术均需要提前进行复杂的电极操作(如:电极预处理和修饰、生物分子固定等)。这种复杂的电极操作过程以及带来的电极批间差异或昂贵的生产成本等,很大程度上限制了该传感技术的进一步发展。研究目的针对上述局限,本研究旨在开发使用简单电极且无需复杂电极操作的CRISPR电化学传感技术,即无需生物分子(报告探针)固定和电极修饰等繁琐步骤的通用性CRISPR电化学生物传感技术。研究内容本研究将从以下两方面开展相关工作:1、免疫磁珠辅助的CRISPR电化学生物传感器技术及其检测SARS-Co V-2的研究:首先,利用CRISPR-Cas13a核酸检测技术和链霉亲和素免疫磁珠辅助捕获报告分子的策略建立一种电极免修饰、无需固定探针的电化学生物传感器。然后,通过将该传感器与RT-RAA等温扩增技术结合,并优化关键反应条件,建立针对目标病原体(以SARS-Co V-2为例)的高灵敏和高特异核酸检测技术。2、扩散介导的CRISPR电化学生物传感技术及其检测SARS-Co V-2和HIV-1的研究:首先,利用CRISPR-Cas13a检测系统以及不同大小相对分子质量的电化学报告探针在溶液中扩散速率差异来构建一种操作更为简单的CRISPR电化学生物传感器技术。然后,通过结合RT-RAA等温扩增技术和优化关键反应条件后,实现对目标病原体(例Smoothened Agonist小鼠如SARS-Co V-2和HIV-1)核酸的快速准确检测。研究方法1、免疫磁珠辅助的CRISPR电化学生物传感器及其检测SARS-Co V-2的研究:首先,设计两端分别标记亚甲基蓝(MB)和生物素(Biotin)基团的电化学报告RNA,通过分析链霉亲和素免疫磁珠辅助分离报告RNA对电化学信号强度影响的效果,验证免疫磁珠吸附并分离报告RNA的可行性,通过测试经Cas13a蛋白体外切割并免疫磁珠辅助分离后的电化学信号强度,验证免疫磁珠辅助的CRISPR电化学生物传感器构建的可行性。然后,从免疫磁珠辅助吸附时间、Cas13a蛋白浓度、Mg~(2+)浓度和Cas13a蛋白切割时间等关键反应条件对上述电化学生物传感器进行优化,以期获得最佳的检测性能。最后,在最优的检测条件下,对该电化学生物传感器的检测性能进行评价,得到其最低检测限和特异性等指标。另外,进一步结合RT-RAA等温扩增技术,建立针对SARS-Co V-2的高灵敏核酸检测方法,并评价其检测灵敏度、特异性和临床样本的检测效果。2、扩散介导的CRISPR电化学生物传感器技术及其检测SARS-Co V-2和HIV-1的研究:首先,评估不同大小相对分子质量的报告RNA扩散率差异导致电化学信RP56976小鼠号响应的差异,验证利用报告分子被Cas13a蛋白剪切前后分子量的变化进一转换成电化学信号差异的可行性。然后结合RT-RAA等温扩增技术,进一步验证扩散介导的CRISPR电化学生物传感器的可行性。通过对报告RNA上的寡核苷酸长度进行筛选,进行传感性能的优化,建立传感技术。再利用该传感技术检测SARS-Co V-2的核酸和HIV-1的核酸,并对其检测灵敏度和检测特异性方面进行性能评价。研究结果1、成功构建了免疫磁珠辅助的CRISPR电化学生物传感器。通过探索该传感器最佳检测条件,使其在无核酸预扩增的情况下可检测到低至10 p M浓度的目标核酸,并具有较好的特异性,能准确识别SARS-Co V-2的HV69-70del突变和D614G突变。建立RT-RAA等温扩增技术结合免疫磁珠辅助CRISPR电化学生物传感器的核酸检测技术,通过优化关键反应条件,使其能检测到低至10~0copies/μL的SARS-Co V-2的核酸,并与其他病原体检测无交叉反应。另外,还利用该传感技术对39个SARS-Co V-2可疑临床样本进行检测,结果发现其中36个临床样本检测结果与RT-q PCR检测结果一致(包括16个阳性和20个阴性),另外还检出了3个RT-q PCR无法检出但数字PCR检测阳性的低拷贝阳性样本,显示出良好的临床实用性。2、成功构建了扩散介导的CRISPR电化学生物传感器。结果表明Cas13a蛋白剪切报告分子前后,可成功将报告分子分子量的变化换能为电化学信号的变化。证明了报告RNA寡核苷酸长度越长越好,考虑到成本因素,最终选定30 nt的报告分子用于后续实验,结合RT-RAA等温扩增技术建立了扩散介导的CRISPR电化学生物传感器传感技术。该传感技术可检测低至10~2 copies/μL的SARS-Co V-2和HIV-1的核酸物质,并与其他病原体无交叉反应,显示了该传感器具有较好的检测灵敏度、特异性和通用性。研究结论1、本研究使用简单丝网印刷碳电极建立的免疫磁珠辅助Cantibiotic expectationsRISPR电化学生物传感器避免了复杂的电极修饰和探针固定步骤,结合RT-RAA等温扩增技术,实现了对SARS-Co V-2的高灵敏检测。该方法为开发用于病原体核酸检测的通用型电化学生物传感技术提供了新的思路。2、扩散介导的CRISPR电化学生物传感器的成功构建,与第一部分传感器研究相比,省去了免疫磁珠辅助过程,进一步简化了传感器的构建步骤,实现了对SARS-Co V-2和HIV-1核酸的准确快速检测,为简易电化学生物传感器的开发提供了新策略。