无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是一种宿主范围广泛的革兰氏阳性菌,能够感染人类和多种动物。近年来,无乳链球菌被认为是造成养殖尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)链球菌病的主要细菌病原体,给罗非鱼养殖业造成了高死亡率和巨大的经济损失。ClpB是一种ATP依赖性分解酶,属于Hsp100/Clp家族,目前在无乳链球菌中ClpB的研究仍是空白。本研究构建了无乳链球菌clpB基因缺失株,初步探究了ClpB在无乳链球菌中的功能,具体研究内容如下:首先,在野生型无乳链球菌强毒株HN016全基因组中比对到一个ClpB同源物,并纯化得到重组蛋白验证其ATP酶活性。通过同源重组方法构建了clpB缺失突变体(ΔclpB)以探究其功能,发现在28℃条件下,clpB的缺失对无乳链球菌的生长和细菌形态没有影响;PORCN抑制剂然而ΔclpB对热和酸性胁迫的耐受性表现出明显缺陷,其存活率分别下降33.58%、89.41%。上述结果表明ClpB对无乳链球菌压力耐受能力,尤其是热和酸性压力至关重要。其次,体外毒力实验发现,相较于HN016,ΔclpB在RAW264.7细胞中的胞内存活率降低了23.78%,并且对罗非鱼脑细胞的粘附力也减弱了10.91%;ΔclpB对罗非鱼头肾白细胞和全血杀伤的敏感性也明显增加,HN016在白细胞杀伤中存活率约为ΔclpB的2.92倍,在全血中的增殖倍数约为ΔclpB的1.68倍。在罗非鱼感染实验中,ΔclpB组的死亡率减少40%,脑、脾和血液中的载菌量也显著下降,证明ClpB在无乳链球菌致病过程发挥重要作用。此外,通过转录组分析探索了?clpB的毒力降低原因,共发现155个差异表达基因,其中123个下调基因、32个上调基因,其中部分差异基因涉及细菌应激反应。Gene Ontology和Kyoto encyclopedia of genes and genomes富集分Adenovirus infection析主要在与细菌代谢相关的途径显著富集,说明ClpB通过调节应激反应和PLX4032说明书代谢途径来间接调控无乳链球菌的毒力。本研究首次在无乳链球菌中明确了ClpB的存在,并证明了ClpB在无乳链球菌抗热和抗酸性应激以及毒力方面的关键作用,丰富了人们对ClpB在革兰氏阳性菌中的功能以及无乳链球菌在感染过程中对抗免疫杀伤的生存策略的认识,为深入解析无乳链球菌致病机理提供科学依据,也为抗菌技术研发提供新靶点。