乳脂是牛奶中的主要营养物质,因其含有丰富的维生素、微量元素以及独特风味,而受到食品和美妆行业的推崇。然而我国牛奶品质普遍低下,国际市场竞争力不足。因此,除了严格加强乳品生产监督和奶牛饲养管理外,从分子水平上提高奶牛乳腺泌乳品质和泌乳量是我们亟待解决的问题。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)是一类转录本大于200个核苷酸的非编码RNA,其数量庞大、种类复杂、功能多样,以多种方式调控机体生物学功能。假基因由蛋白编码基因演化而来,是与同源基因序列相似的一段DNA,其中活性的假基因通常被认作是lnc RNA的亚类,常常与众多疾病相关联,然而假基因在调控奶牛乳腺上皮细胞泌乳、增殖、凋亡与铁死亡能力方面均尚未有文献报道。研究方法:本研究以奶牛乳腺上皮细胞(Dairy cow mammary epithelial cell,DCMECs)为研究模型,首先应用RNA-seq技术,发现miR-223在高品质、低品质、干奶期奶牛乳腺组织中存在显著表达差异,显示miR-223存在重要的泌乳调控功能,然后利用生物信息学软件建立lnc RNA、miR-223和m RNA的ce RNA调控网络。应用q PCR和双荧光素酶报告基因检测技术验证假基因RPS4XP1与miR-223、miR-223与FOXO1 3’UTR区域的靶向结合能力。Western blot实验检测FOXO1蛋白在泌乳期、干奶期、青春期和乳腺炎炎症组织中的表达量。利用p ET-28a体外翻译系统检测假基因RPS4XP1的蛋白编码性。应用脂质体转染技术将miR-223 mimics/mimics NC、miR-223 inhibitor/inhibitor NC、si R-FOXO1、假基因RPS4XP1真核过表达载体和CRISPR-Cas9敲除载体转至DCMECs中。应用免疫荧光技术鉴定提取的原代DCMECs,并使用荧光显微镜检测细胞增殖、凋亡、胞内脂滴合成能力情况。酶活性试剂盒检测细胞甘油三酯分泌情况。使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。应用超高分辨率显微镜观察细胞内FOXO1蛋白出核、入核情况。利用q RCR和western blot技术分别检测泌乳、增殖、凋亡相关基因和蛋白的表达情况。应用共转染技术将miR-223 inhibitor和si R-FOXO1、RPS4XP1过表达载体和miR-223 mimics共同转染至DCMECs,验证假基因RPS4XP1、miR-223和FOXO1的ce RNA调控网络。使用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导并构建奶牛乳腺炎炎症模型,探讨miR-223对LPS诱导的DCMECs炎症反应的影响。应用铁死亡PCR Array技术,探讨假基因RPS4XP1和miR-223对DCMECs铁死亡相关基因表达的影响。研究结果表明:(1)将含有预测靶向结合位点的假基因RPS4XP1和FOXO1 3’UTR野生型与突变型基因片段连接至p Si CHECK2基因报告载体,并分别与miR-223共转染至Hela细胞中进行双荧光素酶活性检测。结果表明,miR-223与RPS4XP1和FOXO1 3’UTR分别靶向结合。q PCR结果表明,假基因RPS4XP1负调控miR-223表达,正调控FOXO1基因表达;miR-223负调控FOXO1基因表达。超高分辨率显微镜与western blot结果表明,miR-223负调控FOXO1蛋白表达。(2)应用p ET-28a体外翻译系统检测假基因RPS4XP1蛋白编码性,结果表明假基因RPS4XP1未翻译出明显蛋白质,为非编码RNA。生物信息学软件预测假基因RPS4XP1的亚细胞定位,结果表明假基因RPS4XP1主要定位在细胞质,其次在细胞核。(3)应用荧光显微镜观察尼罗红染胞内脂滴情况,酶活性试剂盒检测细胞分泌甘油三酯含量,检测miR-223及假基因RPS4XP1对DCMECs乳脂合成的影响,结果表明过表达miR-223可促进乳脂合成,抑制miR-223表达结果与之相反;过表达假基因RPS4XP1可抑制乳脂合成,然而共转染RPS4XP1和miR-223 mimics后,乳脂合成的抑制效果被抵消。(4)通过EDU检测miR-223及假基因RPS4XP1对DCMECs增殖的影响,结果表明过表达miR-223可促进细胞增殖,抑制miR-223的表达结果与之相反;过表达假基因RPS4XP1可抑制细胞增殖,然而共转染RPS4XP1和miR-223 mimics后,细胞增殖的抑制效果被抵消。(5)应用流式细胞仪检测miR-223对DCMEmedication-related hospitalisationCs凋亡的影响,结果表明过表达miR-223可抑制细胞凋亡,相反,抑制miR-223表达可促进细胞凋亡。(6)应用western blot检测泌乳、增殖、凋亡相关蛋白表达情况,结果表明过表达miR-223后,FASN、m TOR、p-m TOR、SREBP1、p-FOXO1、AKT、p-AKT、PPARγ、Cyclin D1和Bcl-2蛋白表达量显著上调,Caspase3和Bax蛋白表达量显著下调;当抑制miR-223表达后,结果与之相反。干扰FOXO1表达后,除p-FOXO1蛋白无显著变化外,FASN、m TOR、p-m TOR、SREBP1、AKT、p-AKT、PQ-VD-Oph分子式PARγ、Cyclin D1和Bcl-2蛋白表达量显著上调,Caspase3和Bax蛋白表达量显著下调;而当共转染si R-FOXO1与miR-223 inhibitor后,上述蛋白表达变化被抵消。除此之外,过表达假基因RPS4XP1后,FASN、m TOR、p-m TOR、SREBP1、p-FOXO1、AKT、p-AKT、PPARγ、Cyclin D1和Bcl-2蛋白表达量显著下调,Caspase3和Bax蛋白表达量显著上调;而当共转染p CDH-RPS4XP1与miR-223 mimics后,上述蛋白表达变化被抵消。敲除假基因RPS4XP1后,结果与过表达组相反。(7)应用LPS诱导并构建奶牛乳腺炎炎症模型,结果表明,LPS可促进FOXO1蛋白在细胞核内聚集,促进miR-223基因表达;miR-223过表达能够抑制LPS诱导的TNF-α蛋白表达,促进FASN蛋白表达;荧光显微镜观察发现,miR-223可降低LPS诱导的细胞凋亡率,促进乳脂合成。(8)应用铁死亡PCR Array检测假基因RPS4XP1和miR-223对DCMECs铁死亡相关基因表达谱的影响。结果表明,假基因RPS4XP1可能通过靶向miR-223调控铁死亡相关基因NOX3、CA9和ALOX15的表达,促进铁死亡发生。综上所述,假基因RPS4XP1主要定位于细胞质,并且不翻译蛋白质,在人和牛物种之间存在序列保守性;假基因RPS4XP1、miR-223与FOXO1之间存在ce RNA调控网络;假基因RPS4XP1可充当miR-223的分子海绵,通过激活AKT/FOXO1、AKT/m TOR信号通路,进而调控DCMECs增殖、凋亡以及乳脂合成;miR-223可减轻LPS诱导的DCMECs炎症反应,抑制细胞凋亡,促进乳脂合成;敲低假基因RPS4XP1表达可能通过靶向miR-223E7080配制抑制DCMECs铁死亡。