茶叶是我国深受喜爱的传统饮品,其产量和品质取决于茶树在各种环境中的生长发育情况。作为叶用植物,茶树真菌侵染引起的茶叶斑病等叶部病害是导致其品质及产量降低的主要原因之一,给优质茶叶的生产带来的巨大压力。茶叶斑病是叶部真菌病害之一,但当前其防治缺乏高效的生物农药。前期研究表明,花青素等具有生物活性的天然产物已被探索成为一种代Staurosporine生产商替化学杀菌剂的有效方法。而茶树中花青素含量丰富,但其对农业病原菌的抑菌活性有待深入研究。本文对花青素差异茶树材料进行茶叶斑病的抗性比较,通过抗性差异材料的代谢组学及转录组学的联合分析对茶树花青素生物合成途径进行解析,并进一步挑选潜在的关键基因进行功能验证,得出以下结论:1.本研究采用PDA培养基从感病叶片表面分离纯化获得四种真菌,分别命名为Tj-A、Tj-B、Tj-C、Tj-D。其中Tj-D的致病力最强,经柯赫氏法则验证其为茶叶斑病致病菌;后对其进行形态学鉴定和序列测定,确定其为可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae),这是首次在杭州茶园的茶叶斑病感病叶片中分离得到该致病菌。紫芽龙井、中茶108、黄金芽、白叶1号、紫娟五个品种茶树被Tj-D侵染,紫芽龙井最晚出现病症且相同时间内被侵染的面积最小。选取花青素含量最高同时也最不易患茶叶斑病的紫芽龙井品种,采用不同光照诱导获得两侧差异颜色叶片,再次进行侵染试验,结果表明遮光侧紫色叶片相较于未遮光侧绿色叶片具有更强的茶叶斑病抗性。花青素含量跟茶树抗病性具有正相关性。2.采用上述实验中经不同光照诱导获得两侧差异颜色叶片为材料,从代谢组、转录组层面进行分析。代谢组结果表明,花青素在遮光侧(紫色叶片)中的含量显著高于未遮光侧(绿色叶片),两组间共筛选到27种显著差异代谢物,其中24种为花青素,除飞燕草素-3-O-芸香糖苷、飞燕草素-3-O-芸香糖苷-5-O-葡萄糖苷、芍药花素-3-O-5-O-(6-O-对香豆酰)-二葡萄糖苷外,其余21种花青素均在紫色叶片中含量更高。紫色叶片中天竺葵素-3-O-半乳糖苷的相对增加量最为显著,相较于绿色叶片提高了51.24倍;矢车菊素-3-O-半medical ultrasound乳糖苷、飞燕草素素-3-O-半乳糖苷的绝对增加量最为显著,相较于绿色叶片分别增加了1128.20μg/g、994.37μg/g。推测花青素半乳糖苷在茶树的抗病性中起到了一定的作用。3.转录组结果表明,紫芽龙井在不同处理组间的差异表达基因主要富集在光合通路和次生代谢产物通路上,其中部分差异表达基因与类黄酮生物合成途径、花青素生物合成途径密切相关。其中FLS(黄酮醇合成酶)基因在紫色叶片中的表达量普遍低于绿色叶片组,表明紫色叶片的二氢黄酮醇流向黄酮醇类物质的趋势较绿色叶片减缓,从而更多流向了花青素合成分支。而UGT(尿苷二磷酸糖基转移酶)家族在遮光紫色叶片中表达量更高的显著差异表达基因,大多作用底物是含花青素在内的类黄酮物质,表明花青素相关的UGT基因对遮光处理表现出了积极的响应。遮光条件下以花青素为作用底物的UGT家族基因的表达量增加,有助于茶树中花青素的积累,该结果与代谢组分析花青素及其糖苷化物含量的上升相一致。4.选取花青素代谢关键基因CSS0020068、CSS0047476,进行克隆与亚细胞定位分析。克隆结果明确了基因selleckchem EPZ-6438的具体序列信息。此外通过农杆菌介导的烟草瞬时表达试验证明35S:GFP-CSS0020068定位及35S:GFP-CSS0047476的荧光未与叶绿体荧光重合。该结果有助于加强我们在分子和细胞层次对这两个UGT基因的认识,为基因功能的进一步验证提供基础。相关工作的开展为花青素合成的定向调控和生物农药开发提供了一定的理论依据。本文探究了茶树花青素对茶叶斑病的抗性,对抗性差异叶片从代谢组、转录组层面进行分析,并从多组学筛选到的花青素代谢关键基因中选取两个进行了克隆及亚细胞定位分析。所得结论为更好的开发利用天然植物源类黄酮化合物提供理论上的依据,为茶园的生物防治提供一定的理论基础。