背景:癫痫,是儿童最常见的中枢神经系统疾病之一,是指各种原因诱导的大脑神经元异常放电所致的脑功能障碍。癫痫病因复杂,当前主流观点认为,其主要与大脑的神经元突触间兴奋性和抑制性神经递质的分泌不平衡有关,即谷氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)代谢失衡。同时,伴随着癫痫症状的持续,人体内部的氧化应激系统发生紊乱,进而导致海马神经元的大量死亡。尽管绝大部分的癫痫能够通过口服抗癫痫药物进行控制,但仍有约2GDC-0068价格0%的癫痫为药物难治性癫痫,其治疗一直是临床上的难点。近几年来,探索通过调控人体的氧化应激系统从而保护神经元的措施为当前的研究热点。铁死亡,作为一种氧化应激系统紊乱而诱导细胞死亡的全新形式,其特征表现为铁离子依赖的脂质过氧化物大量聚集。越来越多的前沿研究表明了铁死亡,尤其是与中枢神经系统疾病密切关联的转录因子核红细胞2相关因子2(Nuclear factor erythroid-2related factor 2,Nrf2)介导的铁死亡通路可作为调控神经元铁死亡的潜在靶点,从而治疗中枢神经系统疾病。随着对铁死亡调控机制研究的深入,天然无毒的生物活性物质槲皮素,被证明可通过其良好的沉寂信息调节因子1(Silent mating type information regulation homolog 1,SIRT1)激活效果从而达到抑制铁死亡的作用。既往的研究提示槲皮素可通过抑制铁死亡治疗急性肺损伤、糖尿病和阿尔兹海默症等疾病。然而,通过槲皮素抑制海马神经元的铁死亡来治疗癫痫的研究尚不完善,相关调控机制尚未得到完整阐明。目的:本旨在研究并讨论铁死亡和癫痫发生的潜在关联,探讨槲皮素通过抑制海马神经元铁死亡而作为癫痫治疗药物的可行性,并初步揭示了槲皮素抑制海马神经元发生铁死亡的潜在分子作用机制。方法:本文首先下载了美国公共基因数据库(GEO)的10个颞叶癫痫脑组织样本和其周围正常脑组织的高通量转录组测序数据进行分析,随后进一步对临床募集来的20个正常儿童及其年龄相对应的20个初发癫痫患儿的外周血进行基因表达分析。通过红藻氨酸诱导癫痫小鼠的经典模型来探讨槲皮素是能否缓解癫痫症状及其是否能够调控神经元铁死亡。通过谷氨酸诱导神经兴奋毒性模型来探讨槲皮素是否能够通过调控神经元铁死亡来达到保护神经元的作用。通过细胞转录组学实验探讨神经元铁死亡是否为槲皮素调控的主要通路之一。结果:一、癫痫的发生与Nrf2介导的铁死亡通路存在关联:公共基因数据库(GEO)的数据结果显示Nrf2介导的铁死亡相关基因的表达在癫痫病变脑组织和周围正常脑组织之间存在统计学LEE011小鼠差异。同时,与正常儿童的外周血对比,Nrf2介导的铁死亡相关基因在癫痫患儿外周血中的表达显著下降,存在统计学差异。在癫痫患者中,Nrf2、SLC7A11及GPX4表达呈正相关趋势,Spearman相关系数分别为0.496及0.481。上述结果提示,Nrf2介导的铁死亡通路可能与癫痫的发生存在关联。二、槲皮素通过抑制Nrf2介导的铁死亡缓解红藻氨酸诱导的癫痫小鼠的症状及海马神经元死亡:(1)在动物实验中,槲皮素预处理组小鼠体重与对照组相比未见明显异常;(2)在动物行为学观察实验中,对比癫痫组小鼠,槲皮素预处理组癫痫小鼠的症状得到明显缓解,同时,铁死亡抑制剂预处理组也出现了相同的现象;(3)在水迷宫实验中,对比癫痫组小鼠,槲皮素预处理组的癫痫小鼠认知功能障碍得到了显著改善,同时,铁死亡抑制组也出现了相同现象;(4)在尼氏染色实验中,对比癫痫组小鼠,槲皮素预处理组和铁死亡抑制剂预处理组的癫痫小鼠的神经元缺失现象均明显改善。生物透射电镜显示,癫痫组小鼠海马组织出现了铁死亡特征性线粒体皱缩,而这一现象在槲皮素及铁死亡抑制剂组预处理的癫痫小鼠中得到改善。(5)对比对照组,癫痫组小鼠海马组织的4HNE、MDA和PTGS2 mRNA含量均明nature as medicine显升高,GSH含量明显下降,而在槲皮素预处理组小鼠的海马组织中这一现象出现了逆转,铁死亡抑制剂预处理组中也观察到了类似的现象。(6)Western-blot结果提示,对比癫痫组小鼠,槲皮素处理组的SIRT1、Nrf2、SLC7A11及GPX4表达明显升高。三、槲皮素通过SIRT1/Nrf2/SLC7A11/GPX4通路抑制神经元铁死亡:(1)在细胞学实验中,CCK-8实验显示谷氨酸处理组的HT22细胞活性下降为对照组的50%左右,而加入了槲皮素或者铁死亡抑制剂后,HT22细胞活性恢复至对照组的90%左右,若同时再加入SIRT1、Nrf2、GPX4的抑制剂,细胞的活性又下降至对照组活性的50%左右;(2)生物透射电镜提示谷氨酸处理的HT22细胞发生了铁死亡特征性线粒体皱缩,而加入了槲皮素或者铁死亡抑制剂处理后,HT22细胞线粒体皱缩的现象得到改善;(3)在细胞学实验中,对比对照组,谷氨酸处理的HT22细胞组的4HNE、MDA和PTGS2mRNA含量明显升高,GSH含量明显下降,而在槲皮素处理的HT22细胞组中这一现象出现了逆转,在铁死亡抑制剂预处理组中也观察到了类似的现象。(4)Western-blot结果提示,对比癫痫组小鼠,槲皮素处理组的SIRT1、Nrf2、SLC7A11及GPX4表达明显升高。(5)细胞免疫荧光学提示,对比谷氨酸处理组,槲皮素处理组的GPX4明显上升。四、Nrf2介导的铁死亡通路是槲皮素调控神经元铁死亡的主要调控通路:(1)对槲皮素处理组及谷氨酸处理组细胞的表达差异基因绘制热图及火山图,结果提示槲皮素处理组会促进海马神经元的SIRT1、Nrf2、SLC7A11、GPX4的基因表达。(2)基于GO和KEGG数据库对槲皮素处理组及谷氨酸组细胞的表达差异基因进行的富集分析,GO数据库富集分析提示程序性细胞死亡在癫痫中起到了重要作用,同时KEGG数据库富集分析进一步证明了铁死亡是主要细胞程序死亡通路。(3)上调基因的蛋白互作网络(PPI)和结合FerrDB数据的韦恩图提示了SIRT1、Nrf2、SLC7A11、GPX4为槲皮素神经元铁死亡的关键基因。结论:本研究探讨并发现了癫痫的发病与Nrf2介导的铁死亡存在关联。同时,天然无毒物质槲皮素可通过SIRT1/Nrf2/SLC7A11/GPX4通路调节神经元铁死亡从而达到保护认知功能及治疗癫痫的作用。本研究进一步支持了铁死亡与癫痫发病的关联,阐明了Nrf2介导的铁死亡通路可作为癫痫治疗的潜在靶点,为未来临床上治疗癫痫的新疗法的开发提供了实验及理论依据。