禽白血病病毒(ALV)是一种致肿瘤性逆转录病毒,分为A-K 11个亚型,其中J亚群禽白血病病毒(ALV-J)在ALV所有亚群中感染率最高、致病性最强、危害最为严重,鸡群感染后会导致严重的免疫抑制与多组织肿瘤发生。近年来,在山东地方鸡发现一株携带v-fps肿瘤基因的致急性纤维肉瘤AL获悉更多V-J毒株(ALV-J-SD1005),其在10 d左右可诱发感染鸡只出现肉眼可见的纤维肉瘤,21 d左右鸡只因肿瘤过度增生而死亡,其致瘤机制尚不清楚。14-3-3σ蛋白是一种细胞周期抑制因子,能够负www.selleck.cn/products/valemetostat-ds-3201性调控细胞周期的进程,研究发现14-3-3σ在多种肿瘤发生发展过程中表达失调或缺失,丧失其对肿瘤细胞增殖的抑制作用,而其在ALV-J致急性纤维组织增生和细胞增殖过程中的作用尚未见报道。本研究利用动物试验和细胞试验探究鸡14-3-3σ在ALV-J毒株致急性纤维肉瘤过程中的作用,为解析ALV-J致肿瘤机制提供新的科学依据。本研究首先根据已发表的鸡14-3-3σ基因序列设计引物扩增鸡14-3-3σ基因并进行序列分析,同时构建重组原核表达载体制备重组蛋白,免疫兔制备检测鸡14-3-3σ表达的多克隆抗体。其次,ALV-J-SD1005毒株颈部皮下注射感染雏鸡分析感染鸡只病毒复制变化、纤维组织增生病变及不同组织14-3-3σ表达变化。第三,ALV-J-SD1005毒株感染DF-1细胞分析病毒复制、细胞增殖和14-3-3σ表达的变化。第四,制备鸡14-3-3σ过表达质粒与小干扰RNA,分别转染进ALV-J-SD1005感染的DF-1细胞中,分析14-3-3σ对细胞增殖、细胞周期、细胞周期调控因子(p53、CDC2和CDK2)的影响。结果显示扩增得到大小为741 bp的鸡14-3-3σ基因,与人的同源性为79%;制备的多克隆抗体可特异性结合鸡组织细胞内14-3-3σ蛋白和诱导表达的蛋白。雏鸡感染ALV-J-SD1005毒株后病毒在体内快速复制;12 d时颈部皮下纤维肉瘤发生率为100%,同时随感染日龄增加,肉瘤指数不断升高,21 d已达到40.4%;14-3-3σ表达显著降低。DF-1细胞感染病毒后细胞增殖显著增加,14-3-3σ蛋白表达显著降低。细胞转染试验结果显示鸡14-3-3σ过表达可显著降低ALV-J-SD1005感染的DF-1细胞的细胞增殖速度和S期细胞比例,但增加G2/M期细胞比例;相反,鸡14-3-3σ敲低表达可显著提高ALV-J-SD1005感染的DF-1细胞的细胞增殖速度和S期细胞比例,但降低G2/M期细胞比例。同时,鸡14-3-3σ过度表达也可以显著下调DF-1细胞中CDK2和CDC2的表达,上调p53的表达;敲低表达可显著增加DF-1细胞中CDK2和CDC2的表达并降低p53的表达。上述结果表明,成功扩增鸡14-3-3σ基因和制备检测其表达的多克隆抗体,为开展其功能研究提供了必要的物质材料;鸡14-3-3σ蛋白可以调节细胞内CDK2、CDC2和p53的表达引起G2/M期细胞阻滞,抑制细胞增殖;Mutation-specific pathologyALV-J-SD1005毒株可通过抑制14-3-3σ蛋白的表达,解除G2/M期细胞阻滞,促进细胞增殖。