目的:本文以桔梗为研究材料,通过转录组和基因表达数据分析,挖掘桔梗类黄酮-3′,5′-羟基化酶(Platycodon grandiflorus flavonoid-3′,5′-hydroxylase,PgF3′,5’H)基因在白花桔梗和蓝花桔梗中的表达差异,研究桔梗花色合成关键基因PgF3′,5’H生物学信息、体外及体内催化功能,旨在为研究桔梗花色相关生物合成路径提供实验基础及理论依据。方法:以桔梗Platycodon grandiflorus(Jacq.)A.DC.作为植物来源,通过分析转录组学和生物学信息,探究桔梗花色合成关键酶基GSK1120212因F3′,5’H在蓝花、白花桔梗之间的基因表达差异。设计PgF3′,5’H特异性引物,经PCR扩增反应得到目标基因单一条带,琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目标条带后,将基因与载Talazoparib体重组转化,测序以确定桔梗基因的碱基序列,使用相关软件预测重组蛋白的三维结构及理化性质等。根据PgF3′,5’H基因基本信息,构建重组蛋白表达体系,诱导重组基因表达活性蛋白,选择最佳提取活性蛋白的方法,采用WB实验验证目标蛋白,根据桔梗花色生物合成路径酶的功能设计氧化还原反应,高效液相检测氧化还原反应中底物的消耗及产物的形成,以验证基因在体外表达蛋白的功能。本文还采用了浸花法将PgF3′,5’H重组基因导入野生型拟南芥中,观察转基因拟南芥花色是否发生改变。采用高效液相色谱法测定转基因T2代拟南芥与野生型拟南芥总黄酮含量的差异,旨在探究PgF3′,5’H对拟南芥黄酮类化合物含量及验证该基因体内重组表达效果。结果:经过转录组学分析发现PgF3′,5’H基因在蓝花、白花桔梗淡黄色花蕾及白花桔梗中的表达量具有明显差异。通过对PgF3′,5’H基因进行生物信息学分析表明,F3′,5’H基因长度为1599 bp,翻译532个氨基酸,蛋白表达化学式为C_(2312)H_(3867)N_(759)O_(971)S_(139),为稳定蛋白质。通过对PgF3′,5’H in pESC-His重组基因表达载体的构建与转化,诱导出活性蛋白,经高效液相色谱法验证该蛋白具有氧化香橙素生成二氢杨梅素的作用。同时构建PgF3′,5’H基因分别插入pET-28a(+)原核表达载体和p CAMBIA1302转基因载体的重组质Liquid Media Method粒,为研究该基因重组蛋白活性功能提供实验基础。经柚皮素、槲皮素、大豆苷元三种标准品在转基因拟南芥中的含量测定,根据转基因拟南芥与阴性组含量比对结果,可知转基因拟南芥中大豆苷元含量没有明显变化,但槲皮素及柚皮素的含量有升高的趋势。生物体内基因调控极为复杂且花冠细胞液泡p H值、相关基因表达强度、启动子作用强弱等都对花色产生重要的影响,其具体机制仍需进一步探索。结论:本文通过比较不同花色桔梗基因差异,经过检索与黄酮类化合物生物合成相关的带有注释的Unigenes,得到白花桔梗淡黄色花蕾和白花桔梗的FPKM值分别为0.26和1.20,而蓝花桔梗的FPKM值为208.85,桔梗蓝花的基因表达水平高于桔梗白花及其幼嫩淡黄色花蕾,表明蓝花桔梗具有更强的产生和积累类黄酮的能力,白花桔梗淡黄色花蕾产生的原因可能是由于黄色黄酮类底物的积累。为该基因的生物合成花色的机理研究提供理论依据及实验基础。通过构建重组质粒及重组蛋白表达体系,设计相关实验验证了PgF3′,5’H具备将香橙素氧化为二氢杨梅素的功能,测定了野生型及转基因拟南芥总黄酮的含量差异。这为桔梗花色苷生物合成相关路径的深入研究提供实验基础。