迷人杜鹃(Rhododendron agastum)为杜鹃花科杜鹃花属常绿杜鹃亚属的灌木或小乔木,主要分布在贵州东部,是百里杜鹃重要的建群种和优势种之一,花大而鲜艳,极具观赏价值。同时,迷人杜鹃花色粉红,富含花色苷,是一种值得研究的天然色素资源,在食品工业中具有一定的开发应用价值。花色是观赏植物的重要性状之一,主要由类胡萝卜素、甜菜碱和类黄酮三类色素决定。研究显示,决定迷人杜鹃花色的主要物质为花色苷,它可以赋予植物粉色、红色、紫色等色调,对花、果实等组织的成色尤为重要,可以极大地提高花朵的观赏价值与果实的口感和风味。在花色苷生物合成途径中,二氢黄酮醇4-还原酶(Dihydroflavonol4-reductase,DFR)位于途径中间,可将三种二氢黄酮醇催化还原为对应的无色花青素,由于其对三种二氢黄酮醇的选择性催化,使其在决定植物花色苷种类上发挥重要作用;而类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶(Flavonoid 3-O-glucosyltransferase,3GT)则位于该途径下游,使花青素经糖基化形成花色苷,在增强花青素稳定性、水溶性和可转运性方面作用关键,直接影响植物色泽的呈现。本研究首先对迷人杜鹃(粉色)与露珠杜鹃(白色)花朵进行了花色苷种类与含量的测定,明确迷人杜鹃开花过程中花色苷含量变化规律,同时在完成二者花朵转录组测序分析的基础上,通过花色苷变化规律与基因表达量之间的相关性分析筛选获得2条调控迷人杜鹃花色呈色的关键基因(Ra DFR1与Ra3GT2),并对其进行功能鉴定。研究结果如下:1.迷人杜鹃花色呈色关键结构基因的筛选首先对迷人杜鹃与露珠杜鹃花朵中的花色苷进行定性分析,结果显示在迷人杜鹃花朵中共检测到7种花色苷,而露珠杜鹃中没检测到花色苷;随后将迷人杜鹃花朵发育过程分为4个时期,通过外标准曲线法完成其花朵发育过程中总花色苷的定量分析,发现伴随迷人杜鹃花的开放,总花色苷的积累水平逐渐降低。根据花色苷定性定量分析结果,初步确定迷人杜鹃花朵中花色苷代谢途径,并与转录组测序结果相结合,通过基因表达量与总花色苷含量变化的相关性分析,筛选到Ra DFR1与Ra3GT2两条调控迷人杜鹃花色呈色的关键结构基因。2.Ra DFR1、Ra3GT2的克隆及生物信息学分析利用RT-PCR方法成功克隆得到Ra DFR1 c DNA序列,而Ra3GT2的转录组测得序列5’端较短,无法设计引物进行克隆,故送公司合成。Ra DFR1和Ra3GT2的开放阅读框长度分别为1035 bp、1395 bp,编码344、464个氨基酸,预测蛋白大小分别为38.34 k Da、50.31 k Da。Ra DFR1和Ra3GT2均为亲水性蛋白且无信号肽。在Ra DFR1的N端有高度保守的NADPH结合位点以及底物结合区,系统进化树显示其与Nt DGut microbiomeFR亲缘关系较近;Ra3GT2属于糖基转移酶GT-B超家族,含有糖基转移酶家族Liraglutide供应商特有的PSPG保守结构域,具有两个糖基转移酶的催化活性位点,与马缨杜鹃Rd3GT1的亲缘关系最近。3.Ra DFR1、Ra3GT2真核表达载体的构建及遗传FG-4592核磁转化以p BI121作为过表达载体,构建Ra DFR1、Ra3GT2的过表达重组子并将其转化至农杆菌GV3101中,分别侵染拟南芥tt3和ugt78d2突变体。结果显示,Ra DFR1、Ra3GT2均可恢复突变体花色苷的合成。为验证两个基因对花色形成的影响,将其在烟草中进行过表达。结果显示,转基因烟草花瓣颜色均有不同程度的加深,同时过表达Ra3GT2烟草花瓣中的花色苷由原来的2种增加至3种,表明这两个基因均具有调控花色苷合成的功能,可以用于植物花色的改良。4.Ra DFR1、Ra3GT2原核表达载体的构建及体外酶活检测成功构建原核表达载体p ET32a(+)-Ra DFR1、p ET32a(+)-Ra3GT2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,制备获得重组蛋白并进行酶活检测。结果显示,Ra DFR1可催化二氢槲皮素、二氢杨梅素生成相应的产物,不具备催化二氢山奈酚的功能,表明其对底物的特异性选择可能是迷人杜鹃中检测不到天竺葵素类花色苷的直接原因。Ra3GT2以UDP-半乳糖为糖基供体时可催化天竺葵色素、矢车菊色素、飞燕草色素、芍药色素、矮牵牛花色素和锦葵色素生成相应的糖苷;以UDP-葡萄糖为糖基供体时则只可催化矢车菊色素、飞燕草色素、锦葵色素生成相应的糖苷。Ra3GT2重组蛋白不能以UDP-阿拉伯糖和UDP-鼠李糖作为糖基供体进行糖基化反应;同时,Ra3GT2还可以UDP-半乳糖、UDP-葡萄糖为糖基供体催化槲皮素、杨梅素以及山奈酚生成相应的糖苷。催化效率分析显示,Ra3GT2无论催化花色素还是黄酮醇,以UDP-半乳糖为糖基供体的催化效率均高于UDP-葡萄糖为糖基供体;所以,Ra3GT2对底物的偏好性直接影响迷人杜鹃花朵中花色苷的多样性。