单碱基编辑技术是针对单个碱基进行替换的基因编辑策略,根据不同的单切口Cas9(Cas9n)脱氨酶分为两个工作系统。其中,嘌呤碱基编辑器(Adenine Base Editors,ABEs)是将编辑活性窗口内的腺嘌呤(A)替换为鸟嘌呤(G),从而将C·G至T·A遗传突变回复纠正。与传统的CRISPR/Cas9基因编辑策略相比,ABEs工作系统基因治疗的效果改善,精确性和安全性进一步提高,具备广泛的应用能力和较高的发展前景。作为一种强大的基因编辑工具,碱基编辑系统也存在着许多技术缺陷,例如靶向范围小、精准性差、Pulmonary Cell Biology编辑活性低、存在脱靶现象等。本研究利用宏基因组分析得到了一种新型腺苷脱氨酶,通过对新型碱基编辑器的突变和改造,进一步提高编辑活性、扩大活性窗口,是碱基编辑工具开发和优化工作的有益尝试。首先,将新型腺苷脱氨酶5V1替换TadA8e脱氨酶,构建5V1-ABE新型碱基编辑器并利用哺乳动物细胞系来检测编辑系统的工作特性。与ABE8e碱基编辑器相比,5V1-ABE编辑器的编辑活性更低,编辑窗口范围更小。因此,根据5V1与TadA8e蛋白同源建模结果,本研究选择Q150/Q151/P152三个靶点对5V1-ABE进行单点突变改造和组合突变改造,得到一种性能更优异的碱基编辑器5V1-GMR-ABE。5V1-GMR-ABE的编辑窗口与5V1-ABE相同为A3-A8,活性窗口内平均编辑效率提高了1.5～3.4倍,并且没有sgRNA依赖性DNA脱靶的产生。它比ABE8e的编辑范围更小,在A5、A6和A8位的编辑活性媲美ABE8e。其次,将新型脱氧腺苷脱氨酶和TadA8e脱氨酶插入到Cas9n蛋白内部的相关耐受位点,构建新型融合表达的碱基编辑器。在测试的11个耐受位点中,1249位点的结果最优。与腺苷脱氨酶位于N-末端的对照编辑器相比,位于1249位点融合表达的碱基编辑器的编辑窗口发生改变,编辑活性提高。其中,ABE8e-1249变体编辑活性提升最为明显,而5V1-1249-ABE和5V1-GMR-1249-ABE突变体的改善效果减弱。此外,本课题研究了ABE8e在小鼠肝脏中进行体内编辑的有效性,搭建了使用脂质纳点击此处米颗粒(Lipid Nanoparticle,LNP)体内递送碱基编辑器及sgRNA的可行方法,可用于在体内验证更多新型碱基编辑器的工作特性。综上所更多述,本研究成功开发新型ABE工具,实现了在哺乳动物细胞的高效编辑,进一步丰富碱基编辑工具库。研究证实LNP介导的ABE8e在小鼠肝脏内高效编辑,为家族性高胆固醇血症提供一种有价值的治疗策略。