目的证实孕期砷暴露对仔代学习记忆能力的损伤作用及初步探索孕期砷暴露诱发胎盘铁死亡的相关分子机制。方法本研究以C57BL/6雌鼠建立体内实验模型,以HTR-8/SVneo细胞(人绒毛膜滋养层细胞)作为体外实验模型。体内实验中,首先建立孕期母鼠砷暴露模型,将亚砷酸钠(Na As O_2)用超纯水配制成相应浓度(0 mg/L、1 mg/L、4 mg/L和16mg/L)用于孕期母鼠饮水砷暴露,采用Morris水迷宫行为学实验测定宫内砷暴露仔鼠(6～7周,性成熟)的空间学习记忆能力相关指标情况,探讨孕期母鼠砷暴露对仔代学习记忆能力的损伤作用;其次,再次建立孕期饮水砷暴露模型,将Na As O_2用超纯水配制成bacterial microbiome相应浓度(0 mg/L和16 mg/L)用于孕期母鼠饮水砷暴露,于怀孕第18天(Gestational day 18,GD18)剖杀取材。孕鼠摘取眼球取血,用含EDTA的抗凝血EP管收集孕鼠全血,保存于-80℃冰箱备用,用于测定母鼠全血中的总砷含量;取血完毕后采用颈椎脱臼法处死孕鼠,记录每只孕鼠所产胎仔数量、胎仔体重和胎仔顶臀长,用于评价胎仔宫内发育的一般情况;收集胎盘组织,数显游标卡尺测定胎盘直径,电子分析天平称量胎盘重量,单独选择完整的胎盘用4%多聚甲醛固定后通过苏木素-伊红染色(H&E)并观察胎盘组织病理损伤情况,其余胎盘组织收集于无菌无酶EP管中,保存于-80℃冰箱以用于测定GSH、SOD、MDA和总铁离子水平以及进行蛋白免疫印记实验(Western blotting)。体外实验中,采用CCK-8细胞增殖毒性实验测定不同Na As O_2浓度(0μΜ、1μM、2.5μM、5μM、8μM、10μM、15μM和20μM)和不同时点(12 h、24 h、36 h和48 selleck化学h)处理Blebbistatin半抑制浓度后HTR-8细胞的活力。最终本研究选择0μΜ、1μM、5μM和15μM的Na As O_2浓度处理HTR-8细胞24 h用于后续相关实验研究。检测细胞内氧化应激相关指标(GSH、SOD、MDA、ROS、HO-1和NQO1)和铁死亡相关指标(GPX4、x-CT、FTH1、Fe~(2+))的含量或表达水平,采用透射电镜观察细胞线粒体形态结构变化。最后通过抗氧化剂NAC(2 m M)和铁死亡抑制剂Fer-1(10μM)分别联合Na As O_2(15μM)共同处理HTR-8细胞,以探索NAC和Fer-1对HTR-8细胞氧化应激反应和铁死亡的发生是否具有逆转作用。结果在第一部分体内实验中,Morris水迷宫实验结果显示Control组和各饮水砷暴露剂量组仔鼠的空间学习记忆能力存在显著差异,主要表现为:在第一阶段定位航巡实验中相较于Control组仔鼠,砷暴露组仔鼠潜伏期显著增加(P<0.05);在第二阶段空间探索实验中相较于Control组仔鼠,砷暴露组仔鼠首次找到平台的潜伏期时间延长和穿越平台次数显著减少(P<0.05),提示母鼠孕期砷暴露可影响仔代的学习记忆能力。在第二部分体内实验探索孕期砷暴露与胎盘铁死亡发生的关系研究中发现:孕期砷暴露对胎盘一般情况及胎仔生长发育情况没有显著影响(P>0.05),显而易见地砷暴露组孕鼠全血和胎盘组织的总砷浓度水平比Control组孕鼠更高;H&E染色结果发现砷暴露能够显著改变胎盘组织的形态结构;分子生物学实验结果显示,砷暴露可降低孕鼠胎盘组织GSH和SOD水平、升高MDA水平和HO-1及NQO1的表达水平,降低铁死亡相关蛋白GPX4、x-CT和FTH1表达水平,增加胎盘组织中总铁离子水平。以上结果提示孕期砷暴露可导致胎盘组织氧化-抗氧化系统破坏,诱发胎盘组织发生铁死亡。体外实验结果显示:Na As O_2处理可降低HTR-8细胞的活力,降低GSH和SOD水平,增加MDA与ROS水平,增加HO-1、NQO1表达水平,降低GPX4、x-CT和FTH1表达水平,Fe~(2+)水平增加并蓄积于细胞内,且细胞内线粒体表现出固缩、体积减少、膜破裂或嵴消失等明显铁死亡样变化。以上结果提示Na As O_2处理能够导致HTR-8细胞发生脂质过氧化反应和铁离子水平失衡,最终导致铁死亡发生。最后通过抗氧化剂NAC和铁死亡抑制剂Fer-1分别联合Na As O_2共同处理HTR-8细胞,结果显示干预剂可有效缓解HTR-8细胞内氧化应激反应(上调被砷降低的GSH、SOD水平,降低MDA水平,下调HO-1和NQO1表达水平,减少ROS水平)且逆转了铁死亡的发生(即GPX4、x-CT和FTH1表达上调,Fe~(2+)水平显著减少且细胞内线粒体固缩、体积减小、膜破裂或者嵴消失的损伤情况得到明显地缓解)。结论孕期砷暴露可导致仔代学习记忆能力损伤;孕期砷暴露能够造成胎盘氧化损伤、脂质过氧化发生,GPX4耗竭及Fe~(2+)蓄积最终导致胎盘铁死亡。未来尚需进一步探索孕期砷暴露诱发胎盘铁死亡致仔代学习记忆能力损伤的潜在关联机制。