目的:类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)可引起滑膜增生、血管翳,骨和软骨损伤,最终可导致残疾。其确切病因尚不清楚,目前普遍认为免疫耐受的下降及自身反应性T、B淋巴细胞的活化可导致RA发病。研究表明RA患者的外周血及滑液中多种炎性细胞因子及血管新生因子分泌增加,如肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor,PDGF)等,最终导致RA成纤维样滑膜细胞增生、血管翳形成以及关节破坏,参与RA的发病。目前针对RA患者的生物靶向治疗(如抗TNFα,抗IL-6等)在临床上取得了很好的疗效,但仍有部分患者对治疗无应答。这提示在RA发病中还有其他的细胞因子参与调控,这促使我们进一步探索RA的发病机制,为其治疗寻找新的靶点。神经胶质细胞分化调节因子样因子(Meteorin-like,Metrnl)又名MeteoriDehydrogenase抑制剂n-β、Subfatin和Cometin,位于人类17号染色体q25.3区域,位于小鼠11号染色体q E2区域。Metrnl为近年来新发现的参与炎症、免疫调节的分泌蛋白。Metrnl主要由脂肪细胞、活化后的巨噬细胞分泌,在黏膜屏障组织、脂肪组织、皮肤和肌肉高表达。目前国内外关于Metrnl的研究主要集中糖尿病、哮喘、炎症性肠病以及心肌梗死等。Metrnl在免疫领域的初步探索源于一个科研团队利用他们自己创建的类风湿关节炎滑膜基因表达数据库发现Metrnl在RA滑膜中高表达,后续学者发现Metrnl在银屑病关节炎患者滑膜液和肌腱附着点的组织样本中高表达,且TNF-α和IL-17均可诱导Metrnl分泌。我们的前期研究发现RA患者血清中Metrnl水平明显升高,且与RA疾病活动度及抗体水平呈正相关。因此我们推测Metrnl可能参与RA发病的调控。为证实该假说,我们拟研究外源性Metrnl对RA-FLS细胞增殖与凋亡的影响;研究Metrnl对RA-FLS炎性细胞因子及血管新生相关细胞因子的影响;同时观察外源性Metrnl对RA的动物模型-胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)鼠发病的影响。为进一步探讨Metrnl在RA发病调控中的信号通路及作用机制,我们通过生信分析在GEO数据库中选取RA相关数据集,发现过氧化物酶体增殖活化因子受体γ(Peroxisome Proliferator Activated Receptorγ,PPARγ)在RA滑膜中低表达。PPARγ属于PPAR的一种亚型,其转录翻译后可参与多种生理功能,在抑制炎症反应、抑制新生血管中发挥重要作用。在糖尿病的研究中发现Metrnl可通过上调PPARγ的表达提高患者的胰岛素敏感性,减少胰岛素抵抗。因此我们猜测Metrnl可能通过上调PPARγ的表达来调控RA患者RA-FLS细胞的增殖、凋亡与功能。为证实这一假说,我们拟检测外源性Metrnl对RA-FLS表达PPARγ的影响。我们对RA-FLS进行PPARγ小感染核酸(small interfering RNA,si RNA)靶向沉默,阻断RA-FLS中PPARγ的作用,观察Metrnl是否通过调控PPARγ而影响RA-FLS细胞的增殖、凋亡与功能。研究方法:1、选取公共数据库中人RA滑膜相关数据集,分析在模型中的PPARγ表达水平。2、不同浓度Metrnl刺激脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的RA-FLS炎症细胞模型,RT-PCR检测炎性因子PPAR-γm RNA的表达;Western blot检测PPAR-γ蛋白的表达;3、不同浓度Metrnl刺激LPS诱导的RA-FLBIBW2992分子量S炎症细胞模型,CCK8法及流式细胞术检测FLS的增殖与凋亡。并进一步检测在si RNA介导的PPARγ抑制的状态下,Metrnl对RA-FLS的增殖与凋亡的影响。4、不同浓度Metrnl刺激LPS诱导的RA-FLS炎症细胞模型,RT-PCR检测IL-6、TNF-α、IL-17及VEGF、PDGF的m RNA表达;Western blot检测IL-6、TNF-α、IL-17及VEGF、PDGF的蛋白表达;ELISA检测上清液中细胞因子IL-6、TNF-α、IL-17及VEGF、PDGF的分泌水平。5、对LPS诱导的RA-FLS炎症细胞模型进行si RNA介导的PPARγ靶向沉默:RT-PCR检测IL-6、TNF-α、IL-17及VEGF、PGDF m RNA的表达;Western blot检测IL-6、TNF-α、IL-17及VEGF、PDGF蛋白的表达;ELISA检测上清液中IL-6、TNF-α、IL-17及VEGF、PDGF的分泌水平。6、选用DBA/1J鼠建立CIA小鼠模型,分别对模型组及实验组,腹腔注射磷酸缓冲盐溶液(Phosphate Buffer Saline,PBS)及Metrnl,关节骨组织进行番红固绿染色、苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色,评估Metrnl在CIA小鼠模型软骨与骨破坏中的作用。结果:1、GEO数据库生信分析提示:PPARγ在RA患者的滑膜组织中表达下调-2.28倍。2、不同浓度Metrnl(0、50、100、200及300imaging geneticsng/m L)刺激LPS诱导的RA-FLS炎症细胞模型后,RT-PCR检测RA-FLS细胞PPARγ的m RNA表达升高,Western blot检测RA-FLS细胞PPARγ的蛋白表达升高。3、不同浓度Metrnl(0、50、100、200及300ng/m L)刺激LPS诱导的RA-FLS炎症细胞模型后:(1)CCK8法检测RA-FLS的增殖状态发现:Metrnl可抑制RA-FLS的增殖,且存在浓度依赖性。而PPARγsi RNA靶向沉默不能拮抗此抑制作用。(2)流式细胞术法检测RA-FLS的凋亡状态发现:Metrnl可促进RA-FLS的凋亡,且存在浓度依赖性。而PPARγsi RNA靶向沉默可拮抗Metrnl对RA-FLS细胞凋亡的促进作用4、不同浓度Metrnl刺激LPS诱导的RA-FLS炎症细胞模型后:(1)RT-PCR检测RA-FLS细胞TNF-α、IL-6、IL-17、VEGF及PDGF的m RNA表达明显下降,且存在浓度依赖性。而PPARγsi RNA靶向沉默可拮抗Metrnl对IL-17及PDGF的m RNA表达的抑制作用,但不能拮抗Metrnl对TNF-α、IL-16及VEGF的m RNA表达的抑制作用。(2)Western blot检测RA-FLS细胞TNF-α、IL-6、IL-17、VEGF及PDGF的蛋白表达明显下降,且存在浓度依赖性。而PPARγsi RNA靶向沉默可以拮抗Metrnl对RA-FLS细胞炎性细胞因子及血管新生相关因子蛋白表达的抑制作用。(3)ELISA检测RA-FLS细胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-17的分泌水平明显下降,且具有浓度依赖性。而PPARγsi RNA靶向沉默拮抗Metrnl对RA-FLS炎性细胞因子及血管新生相关因子的分泌的抑制作用。5、CIA+Metrnl组和CIA组小鼠对比对照组体重下降明显,但CIA+Metrnl组体重整体高于CIA组;CIA+Metrnl组关节肿胀度、关节炎指数明显低于CIA组。HE染色提示Metrnl显著减轻滑膜增生及炎性细胞的浸润、聚集以及骨组织的破坏。番红固绿染色中提示Metrnl可显著减轻CIA关节软骨的破坏。结论:Metrnl靶向调控PPARγ抑制LPS诱导的RA-FLS细胞增殖并促进凋亡,抑制炎性细胞因子和血管新生因子表达,减缓CIA小鼠模型的炎症反应和软骨损伤。Metrnl为RA的发病机制研究提供了新的理论基础,或成为新的药物靶点。