苯丙烷代谢途径是植物中重要的次生代谢途径之一,多种次生代谢产物都是由这一途径直接或者间接生成,然后进入类黄酮、木质素等化合物的下游合成途径。C4H(肉桂酸4-羟化酶)是苯丙烷代谢途径中的关键酶,参与调控植物类黄酮和植物木质素的生物合成。通过转录组和qRT-PCR联合分析,筛选并鉴定了一个CtC4H1基因。对CtC4H1系统发育、蛋白结构、理化性质等方面进行了详细分析。对于异源表达CtC4H1拟南芥和病毒诱导CtC4H1沉默的红花进行了表型分析、次生代谢产物含量测定及通路基因表达量的分析。对于CtC4H1蛋白相互作用网络进行了预测,亚细胞定位分析、酵母双杂交(Y2H)以及双分子荧光互补(BiFC)技术明确了CtC4H1蛋白的定位情况及互作蛋白。分析了CtC4H1对非生物胁迫响应的表达水平存在的差异,在干旱胁迫下揭示了CtC4H1转基因拟南芥的抗氧化性能。具体研究结果如下:1.基因组测序获得2条候选CtC4H基因,通过转录组数据的GMO biosafety热图分析和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析发现,CtC4H1的表达量始终高于CtC4H2,所以选择CtC4H1进行克隆研究,其编码区为1518 bp。多序列比对和同源性分析表明,红花中CtC4H1基因与其他物Captisol细胞培养种中C4H进化关系密切,都具有细胞色素P450结构域、膜锚区、脯氨酸丰富区、苏氨酸结合区、血红素结合区和E-R-R三联体结构域,同时,CtC4H1具有CYP73A亚家族的6个特征底物识别位点,包括(SRS1、SRS2、SRS3、SRS4、SRS5和SRS6),与CYP73A亚家族最接近。并且,CtC4H1蛋白是亲水性不稳定蛋白,具有一个跨膜结构域和丰富的磷酸化位点。2.异源表达CtC4H1拟南芥经逐代筛选,经基因组鉴定和qRT-PCR分析,得到12株T3代转基因拟南芥,并从中选择了OE4和OE10两个高表达株系。对于野生型(WT)和两个过表达株系(OE4和OE10)生长发育阶段的表型统计分析显示,与野生型相比,转基因拟南芥具有更为明显的长势。CtC4H1转基因拟南芥的叶片偏大且莲座叶数目更多,抽薹时间稍早且茎的直径偏大,并伴随着茎端紫色色素的积累。CtC4H1转基因拟南芥中总黄酮含量为野生型中的1.5倍,而花青素含量则为野生型的2.5倍。过表达植物中参与黄酮类物质生物合成的基因(At PAL、At4CL、At CHS、At CHI、At F3H、At F3’H、At FLS、At DFR和At ANS)的表达显著上调,其中,At PAL基因最高上调了130倍。3.病毒诱导(VIGS)红花CtC4H1基因沉默实验中,对于TRV病毒介导下的CtC4H1植株沉默效率进行检测,选择了沉默效率较高的Line 1和Line 3进行对比分析。对注射前后的红花植株的表型观察发现,瞬时过表达的植株显示出比对照稍好的生长趋势,尤其是在注射七天时的生长状态。而基因沉默后的植株随着时间的推移显示出明显的叶片黄化情况,并且植物的生长受到阻遏显示出生长延缓的趋势。TRV病毒介导下的CtC4H1基因沉默的红花中总黄酮含量为空载对照的0.3-0.5倍,而花青素的含量为空载对照的0.3-0.6倍,参与黄酮类物质生物合成的基因(CtPAL、CtCHS、CtCHI、CtF3MK-1775’H、CtFLS、CtDFR和CtANS)的表达显著降低。4.对红花中CtC4H1的相互作用网络进行了预测,结果显示C4H蛋白与通路上其他蛋白(PAL,4CL,HCT,FLS,ANS等)存在密切的关联以及相互作用的可能,利用烟草叶片细胞瞬时表达系统分别对CtC4H1和CtPAL1进行亚细胞定位分析,两个蛋白的定位主要分布于质膜和细胞核中。通过酵母双杂交(Y2H)验证了CtC4H1和CtPAL1蛋白之间存在互作的潜能,利用双分子荧光互补(BiFC)技术验证两个蛋白存在互作关系。5.通过qRT-PCR技术验证了CtC4H1基因在干旱、茉莉酸甲酯、光和暗等不同激素和非生物胁迫条件下的表达水平。与其他处理相比,在外部干旱处理下CtC4H1基因的表达水平从48 h开始显著提高且有持续增加的现象,结果表明CtC4H1具有调控红花应对干旱胁迫的反应机制。6.选择了CtPAL1和CtC4H1过表达拟南芥株系,研究这两个基因在干旱胁迫下过表达株系中的作用。两个CtC4H1过表达系(OE4和OE10)和CtPAL1过表达系(OE6)在干旱胁迫14 d后的表型分析表明,与WT拟南芥相比,干旱受损的叶子程度稍轻。3,3’-二氨基联苯胺(DAB)和硝基蓝四唑(NBT)对实验植株的叶片进行染色以及含量测定结果表明,转基因植株的过氧化氢(H_2O_2)和超氧阴离子(O_2~-)积累量少于对照株。干旱胁迫后转基因株系中总黄酮类化合物和花青素含量显著增加,转基因叶片的MDA含量明显低于WT。与野生型拟南芥相比,干旱胁迫诱导下转基因株系中参与活性氧(ROS)解毒的SOD、CAT、POD的活性以及脯氨酸的含量增加明显。以上结果表明,CtC4H1和CtPAL1基因可以促进黄酮类化合物的积累,刺激抗氧化防御系统,从而促进拟南芥中ROS的清除。