研究背景与目的口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cNSC 127716临床试验ell carcinomaCobimetinib IC50,OSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤,其转移及致死率均较高.目前常用的治疗手段以手术治疗为主,放,化疗为辅,但肿瘤所在解剖部位及放化疗所带来的毒副反应严重影响了口腔鳞癌患者的生存质量.近年来热疗(Hyperthermia,HT)作为一种无创且副反应小的疗法得到了广泛的研究及临床应用,这些结果证明热疗能够有效增敏放化疗的疗效,促进肿瘤细胞死亡.目前细胞死亡主要分为调节性细胞死亡(regulated cell death,RCD)或程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)和细胞意外死亡(accidental cell death,ACD)两大类.根据加热温度,一般将热疗分为温热治疗(41～45℃)和热消融治疗(55℃以上),研究表明较高温度下细胞死亡以ACD为主,随着温度的降低细胞死亡转变为以PCD为主.其中铁死亡是被重点关注的一个因素.铁死亡(Ferroptosis)是一种铁依赖的PCD形式,活性氧(reactive oxygen species,ROS)引起的脂质过氧化反应是目前公认的铁死亡的生化标志.研究表明,通过激活p53/Tf R1轴可调节细胞内铁水平进而调控铁死亡进程.p53是重要的抑癌基因,在多种肿瘤尤其是头颈鳞癌中高度突变,不能发挥抑癌作用,而转铁蛋白受体1(Transferrin receptor 1,Tf R1)在肿瘤中的高表达常与不良预后有关,并被认为是一种新的肿瘤治疗靶点.本研究旨在通过分子生物学方法探究HT对OSCC铁死亡的调控作用及相关机制,进一步探究热疗引起的铁死亡对OSCC生物学行为的影响,为OSCC的治疗提供新的靶点,为口腔鳞癌的临床治疗提供新的治疗思路.实验方法1.通过生信数据库进行检索,得到铁死亡的相关蛋白互作网络,分析相关因子在癌及癌旁组织(肿瘤边缘0.5cm)中表达差异情况,并对相关通路进行验证.2.临床收集口腔鳞癌患者病理组织切片,免疫组织化学染色法检测口腔鳞癌的癌和癌旁(肿瘤边缘)正常组织中Tf R1,HSPA8表达水平.3.CCK-8法检测铁死亡抑制剂Ferrostain-1(Fer-1)的半数抑制浓度IC_(50).4.通过活性氧检测试剂盒检测各分组细胞活性氧表达水平.5.铁离子浓度检测试剂盒检测各组细胞铁离子浓度.6.q RT-PCR和WB检测各处理组中,HT对细胞铁死亡通路的调控作用.7.细胞划痕实验检测各组细胞的迁移能力.8.流式细胞(Annexin V FITC/PI双染)凋亡试剂盒检测各组细胞的细胞凋亡量.实验结果1.STRING数据库检索得到p53/Tf R1/HSPA8蛋白互作网络,TIMER数据库检索结果示Tf R1,HSPA8在头颈鳞癌中显著高表达,p53无显著差异.2.IHC结果显示,HSPA8和Tf R1在OSCC组织中的表达量明显高于癌旁正常组织(肿瘤边缘0.5cm).3.CCK8法测定Fer-1在Cal-27细胞系中的IC_(50)值为1.184μmol/L,并用于后续实验.4.活性氧检测试剂盒检测各组细胞活性氧表达水平,结果显示HT组ROS明显升高(P<0.01),HT+Fer-1组ROS与HT组相比明显降低(P<0.01).5.铁离子浓度检测试剂盒检测结果显示,HT组铁离子浓度明显高于Control组(P<0.001),HT+Fer-1组铁离子浓度与HT组相比明显降低(P<0.01).6.q RT-PC和WB检测各组细胞铁死亡相关基因,目标信号通路基因及蛋白表达,结果显示:HT组铁死亡抑制基因GPX4,SLC7A11表达量降低(P<0.05),铁死亡相关信号通路分子p53,Tf R1及HSPA8的基因及蛋白表达量上调(P<0.05);HT+Fer-1组铁死亡抑制基因GPX4,SLC7A11表达量较HT组升高(P<0.05),而铁死亡相关信号通路分子p53,Tf R1及HSPA8的基因及蛋白表达量降低(P<0.05).7.细胞划痕实验结果显示HT可明显降低口腔鳞癌细胞的迁移能力(P<0.05),HT+Fer-1组迁移能力恢复(P<0.05).8.用流式细胞法检测细胞的凋亡情况,结果显示:HT组细胞凋亡率明显提高(P<0.05),HT+Fer-1组凋亡率较HT组明显降低(P<0.05)结论1.人OSCC组织中Tf R1,HSPA8表达量显著高于癌旁组织,可能与肿瘤形成有关.2.43℃HT可上调细胞内ROS以及相关细胞因子促进CAL-27发生铁死亡.3.association studies in genetics43℃热疗可通过激活p53/Tf R1/HSPA8通路诱发CAL-27细胞铁死亡.4.43℃热疗可能通过诱导CAL-27细胞铁死亡从而抑制CAL-27细胞的迁移能力,并促进其凋亡.