对苯二酚(Hydroquinone,HQ)作为一种天然高效的美白成分,曾被广泛添加于护肤品中,但其具有一定的细胞毒性。α-熊果苷作为HQ的天然衍生物,具有稳定性好,毒副作用少等优势,在化妆品、食品、医药等领域具有巨大的应用价值。目前通过酶法催化是普遍认可的一种最安全高效的合成α-熊果苷的方式。蔗糖磷酸化酶(Sucrose phosphorylase,简称SPase)是一种应用最广的合成α-熊果苷的酶,其原理是通过将蔗糖分子中的葡萄糖苷转移到HQ分子上从而得到α-熊果苷。但是目前已经筛选得到应用于α-熊果苷生产的SPase存在种类较少,催化活力不高的缺陷。因此,本研究的目的是从生物数据库中挖掘到一种新的高催化活性的SPase,对其进行酶学表征,并且将其应用于α-熊果苷的生物合成,最后通过半理性设计对其进行分子改造以提高其催化活性。具体研究内容如下:(1)本研究通过序列比对选择了五种不同微生物来源的SPase基因进行密码子优化以及合成,并且将合成得到的目的基因克隆到重组载体p ET20b(+)中,随后将重组质粒转入大肠杆菌细胞中表达,并通过引入诱导型分子伴侣质粒p G-Tf2表达分子伴侣蛋白Gro ES-Gro EL和Tf因子成功解决了SPase在大肠杆菌中的表达是以不可溶且无活性的包涵体形式存在的问题。成功构建了一Extra-hepatic portal vein obstruction个由5种SPase组成的小型酶库,用于筛选高催化性能的SPase。通过对粗酶液进行初步的催化性质分析VEGFR抑制剂,选择了合成a-熊果苷水平较高的来源于Paenibacillus elgii的SPase(Pe SP)作为出发酶进行后续的研究。通过共表达条件优化发现在OD_(600)为0.9时向培养基中加入终浓度为0.05 m M的IPTG和10 ng×m L~(-1)的四环素作为诱导剂,在20℃、180 rpm摇床培养20 h,蛋白的可溶性水平最高,Pe SP的粗酶液酶比活力从77.63U×mg~(-1)提高到了91.64 U×mg~(-1)。(2)对经纯化的重组Pe SP的酶学性质进行分析,结果表明其最适温度为35℃最适p H为7.0,在35℃的半衰期为3.6 h,在p H 6.5-8.5稳定性较好,对于高浓度金属离子较敏感。以蔗糖为底物的K_m、V_(max)、K_(cat)值分别为14.50 m M、227.27μmol×mg~(-1)×min~(-1)以及141.88 min~(-1)。优化重组Pe SP生物催化合成α-熊果苷的反应条件,发现在30℃,p H 7.0的条件下,利用摩尔比为5:1的蔗糖与HQ通过200U×m L~(-1)的Pe SP催化反应25 h可获得的a-熊果苷最高产量为52.60 mg×m L~(-1),HQ转化率为60.9%。(3)为提高Pe SP的催化能力,对其进行了半理性改造。通过对影响Pe SP活性最明显的3个氨基酸残基进行定点饱和突变,获得了两个活性提高的突变体(K160E和R348I),对突变体进行酶学性质分析与合成熊果苷条件优化。发现突变体K160E和R348I的比活力分别为215.42 U×mg~(-1)和202.36 U×mg~(-1),提高到了原来的1.27和1.19倍,突变体的K_(cat)值分别为204.25 min~(-1)和173.92 min~(-1),提高到原来的1.44和1.22倍,说明突变体相对于野生型Pe SP来说对底物的亲和性都有所提高,但是突变体的热稳定性相比野生型都有所下降。突变体转化HQ合成a-熊果苷的最高产量分别为65.73 mg×m L~(-1)和58.73 mg×m L~(-1),提高到原来的1.25倍和1.12倍,HQ转化率分别为79.01%和70.60%,提高到原来的1.09倍和1.06倍。此外,本研究还对影响Pe SP稳定性的关键氨基酸残基进行了分析,找到了对Pe SP热稳定性影响较大的氨基酸VX-445试剂残基,为优化SPase稳定性提供了参考。