神经退行性疾病是机体神经元结构或功能逐渐丧失直至神经元死亡而导致神经系统功能障碍的一类疾病,严重威胁着人类健康和生活质量。神经退行性疾病的诱因及发病机制不尽相同,但在病变的神经组织中均存在明显的氧化应激造成的细胞损伤,这是引起神经退行性病变的重要原因。近年来的研究发现,氧化应激直接导致线粒体能量代谢失调并进一步损伤线粒体,从而促进神经退行性疾病的发生发展。虽然目前关于线粒体氧化损伤与神经退行性疾病相关性的研究报道较多,但对于线粒体氧化损伤的分子机制尚不明晰。Prx Ⅱ是过氧化物酶家族中的一员,其依赖于结构上半胱氨酸残基能清除机体内的ROS,降低细胞内氧化应激水平,从而参与细胞多种功能。我们研究发现Prx Ⅱ能保护酒精通过氧化应激诱导海马神经元线粒体依赖性细胞凋亡。这提示Prx Ⅱ是调控氧化应激诱导海马神经元线粒体损伤的关键基因。因此,本研究为进一步探究Prx Ⅱ调控氧化应激诱导线粒体损伤的分子机理,我们以小鼠海马神经元细胞系HT22为研究对象,阐明氧化应激诱导线粒体损伤的机制,并通过RNA测序结合细胞生物学研究方法明确Prx Ⅱ在其中发挥的调控作用途径,为氧化应激诱导神经退行性疾病immune pathways发生发展的预防和治疗提供基础理论。酒精处理海马神经元细胞系HT22,1、采用透射电镜、流式细胞术、蛋白免疫印迹等技术结合Ca2+螯合剂BAPTA,检测酒精处理后mock和shPrx Ⅱ HT22内MAMs形成通过调控线粒体Ca2+水平对线粒体损伤及线粒体依赖性细胞凋亡的调控作用。2、分别对酒精处理后mock和shPrx ⅡHT22进行RNA测序,对MAMs形成机制进行分析,并分别采用qRT-PCR和蛋白质免疫印迹在mRNA和蛋白质水平上进行验SCH727965化学结构证。3、根据RNA测序结果结合生物信息学分析,检测发挥调控线粒体运输作用miRNA的表达情况,在RNA水平上进行验证。4、根据筛选得到的miRNA,结合Jaspar数据库预测能调控miRNA的转录因子,对预测出的转录因子进行验证,并对Prx Ⅱ可能调控转录因子的信号通路进行分析检测。结果发现:1、在采用透射电镜对酒精处理后HT22观察时,shPrx ⅡHT22内MAMs形成明显增多,线粒体Ca2+水平升高。在重新转入Prx Ⅱ后,酒精处理后shPrx Ⅱ HT22内线粒体Ca2+水平下调。在加入Ca2+螯合剂BAPTA后,酒精处理后shPrDibutyryl-cAMP半抑制浓度x Ⅱ HT22内线粒体Ca2+水平下调,线粒体膜电位恢复,线粒体依赖性细胞凋亡被抑制。2、对酒精处理后mock和shPrx ⅡHT22进行RNA测序,采用共聚焦显微镜对线粒体亚细胞定位情况进行检测,结果显示酒精处理后shPrx Ⅱ HT22内线粒体显著聚集在细胞核周围。对酒精处理后mock和shPrx Ⅱ HT22进行RNA测序发现,调控线粒体运输关键蛋白Armcx3表达水平显著下调,并在RNA和蛋白质水平上都进行了验证。3、为探究Prx Ⅱ如何调控Armcx3 mRNA水平下调,利用miRWalk,miRDB,starBase生物信息学软件分析能调控Armcx3 mRNA表达的miRNA,互取交集共有18个,利用qRT-PCR筛选,其中仅miR-181b-5p表达水平上调。4、结合Jaspar数据库预测能调控miR-181b-5p的转录因子,发现转录因子ATF3可与miR-181b-5p前体互相结合,且在后续证明Prx Ⅱ通过清除ROS,调控ERS,激活PERK信号通路调控转录因子ATF3表达。综合上述结果得出以下结论:1、酒精能通过氧化应激抑制海马神经元细胞内Armcx3表达,抑制线粒体运输并促进线粒体相关内质网膜形成,导致线粒体Ca2+水平升高,诱导线粒体损伤进而引起线粒体依赖性细胞凋亡。2、Prx Ⅱ基因能抑制氧化应激通过ERS激活PERK信号通路,抑制转录因子ATF3转录,抑制miR-181b-5p表达,进而调控Armcx3表达水平,从而保护酒精诱导海马神经元线粒体损伤和线粒体依赖性细胞凋亡。总而言之,我们阐述了 Prx Ⅱ保护酒精诱导线粒体氧化损伤的分子机制,为以线粒体相关内质网膜靶向调控线粒体氧化损伤提供基础理论和实验依据,为治疗神经退行性疾病提供新思路和新视角。