目的:酒精使用障碍(Alcohol use disorder,Hepatoprotective activitiesAUD)是世界范围内影响公共健康的严重问题。过量饮酒会导致神经炎症、认知衰退、烦躁抑郁和运动功能障碍,这与长期酒精暴露导致的肠道菌群紊乱和肠黏膜屏障受损密切相关。肠道中的微生物可通过肠道和中枢神经系统之间的双向传递,将其影响延伸到大脑进而调控生理病理过程,最终在中枢神经系统形成肠道-微生物-脑轴。岩藻多糖(Fucoidan)是一种提取自海藻的天然活性物质,具有抗氧化、抗炎和改善肠道微生态等活性。在前期研究中,我们发现岩藻多糖能够调节肠道微生物群的组成,改善肠粘膜损伤,进而改善小鼠的酒精性肝损伤。而岩藻多糖是否可通过肠道-微生物-脑轴改善酒精暴露诱导的脑损伤还鲜有报道。因此,本实验将探讨岩藻多糖是否通过调节肠道微生态,增强肠道粘膜屏障功能减轻酒精依赖小鼠的神经炎症,改善其抑郁样行为。方法:1.酒精依赖小鼠模型构建及干预方案:采用45只8周龄雄性C57BL/6J小鼠,首先进行3周的合笼喂养,使小鼠肠道菌群构成更均匀。干预前根据蔗糖偏好实验结果将小鼠随机分为3组(15只/组),对照组、模型组和岩藻多糖干预组。干预期间,每周一至周五的8时至16时,模型组和岩藻多糖干预组小鼠自由饮用自来水,其余时间自由饮用现配的15%乙醇溶液,对照组小鼠在此期间均自由饮用自来水;周六对所有小鼠进行戒断;周日所有小鼠自由饮用自来水。干预期间,对照组和模型组小鼠每天中午12时灌胃0.2 m L生理盐水,岩藻多糖干预组小鼠灌胃等体积的300 mg/kg岩藻多糖溶液。干预实验持续10周,所有小鼠均可自由进食。2.采用行为学实验检测各组小鼠的抑郁样行为,包括蔗糖偏好实验、强迫游泳实验、旷场实验和Y迷宫实验。3.利用酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠血清及脑组织中5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)和脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的水平。采用ELISA法检测小鼠血清中脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)及脑组织中转化生长因子-β(TraRSL3研究购买nsforming growth factor-β,TGF-β)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、IL-10和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的水平。4.利用Western blot检测小鼠海马组织中小胶质细胞标记物Iba-1,活化小胶质细胞标记物CD68以及TLR4/MyD88/NF-κB p65信号通路相关蛋白的表达水平;检测回肠组织中紧密连接蛋白Claudin-2、ZO-1表达水平。5.利用免疫荧光实验观察小鼠海马组织中Iba-1、CD68以及p-NF-κB p65的表达;观察回肠组织中紧密连接蛋白Claudin-2、ZO-1表达水平。6.利用16S rDNA基因测序实验检测各组小鼠肠道微生态的构成变化及差异。7.利用Spearman相关分析方法分析血清学指标与属种间的相关性。通过Pearson相关分析,对脑组织炎性因子和海马蛋白表达与属种间的相关性进行分析。结果:1.酒精暴露10周后,模型组小鼠摄食量(1.71±0.70 g)和体重(24.47±2.17 g)下降均显著低于正常对照组(分别为3.15±0.52 g和27.68±2.21 g)(P<0.01)。岩藻多糖干预组小鼠摄食量(2.65±0.93 g)高于模型组(P<0.05)。2.与对照组相比,酒精暴露10周后模型组小鼠对甜味溶液的偏好显著降低了24.18%(P<0.05);强迫游泳实验中,静止时间显著增加了78.01%(P<0.01);Y迷宫实验中,进入新奇臂的时间减少了66.98%(P<0.01);旷场实验中,进入中心的次数和停留时间明显减少,总运动距离也产生显著差异(P<0.05)。与模型组相比,岩藻多糖干预后小鼠的行为学测试结果得到明显改善(P<0.05)。3.与模型组相比,岩藻多糖干预组小鼠血清中IL-1β和TNF-α的水平分别降低了40.96%和49.02%,TGF-β和IL-10水平分别提高了33.16%和88.27%(P<0.05或P<0.01)。模型组小鼠相较于对照组,血清中NGF、BDNF和5-HT水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。岩藻多糖干预后,BDNF和5-HT水平分别提高了40.85%和48.29%(P<0.05)。此外,岩藻多糖干预使酒精暴露小鼠血清中LPS水平显著降低了19.79%(P<0.05)。与对照组相比,模型组小鼠脑组织中NGF、BDNF和5-HT水平的变化与血清中相似,岩藻多糖干预后BDNF和5-HT水平分别降低了49.70%和39.33%(P<0.05)。4.Western blot结果显示,与对照组相比,模型组小鼠海马组织中Iba-1表达无明显变化,CD68表达显著增加(P<0.01),且TLR4、MyD88和p-NF-κB p65蛋白水平显著升高(P<0.05);回肠组织中紧密连接蛋白Claudin-2、ZO-1表达显著降低(P<0.01)。岩藻多糖干预后,均得到明显改善。5.在免疫荧光检测中,三组小鼠海马组织中小胶质细胞的数量没有明显变化。与对照组相比,模型组小鼠海马组织中CD68蛋白表达明显增强,说明酒精暴露促进了小胶质细胞的活化(P<0.05);p-NF-κB p65蛋白染色增强,说明酒精暴露上调了TLR4/MyD88/NF-κB p65通路;回肠组织中紧密连接蛋白Claudin-2、ZO-1染色减弱。岩藻多糖干预后,均得到明显改善。6.16S rDNA测序结果显示,三组小鼠肠道菌群的多样性和构成结构具有差异性。与正常对照组相比,酒精暴露增加了拟杆菌属(Bacteroides)和艾克曼菌属(Akkermansia)的丰度,降低了普雷沃氏菌属(Prevotella)、异普雷沃氏菌属(Alloprevotella)、巴氏菌属(Barnesiella)和另枝杆菌(Alistipes)的丰度(P<0.05或P<0.01)。岩藻多糖可调节肠道菌群结构,使菌群组成与正常对照组小鼠更相似,增加了普雷沃氏菌(Prevotella)和异普雷沃氏菌(Alloprevotella)的丰度(P<0.05)。7.Spearman相关性分析显示,异普雷沃氏菌属(Alloprevotella)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、另枝杆菌(Alistipes)和黏液螺旋菌(Mucispirillum)的丰度与血清BDNF水平呈正相关,而梭状芽胞杆菌属ⅩVIII(ClostridiumⅩVIII)、布劳特氏菌属(Blautia)、粪厌氧棒形杆菌(Anaerostipes)和艾克曼菌属(Akkermansia)的丰度与血清BDNF水平呈负相关。普雷沃氏菌和巴恩斯氏菌的丰GW-572016度与血清5-HT水平呈正相关,布劳特氏菌的丰度与血清5-HT水平呈负相关。Pearson相关性分析显示,普雷沃氏菌属(Prevotella)丰度与IL-1β水平呈负相关。另枝杆菌(Alistipes)的丰度与脑TNF-α、IL-6、IL-1β和海马CD68的表达水平呈负相关。结论:1.口服岩藻多糖可以降低血浆内LPS水平,下调TLR4/MyD88/NF-κB p65通路,抑制酒精诱导的神经炎症,对酒精暴露小鼠发挥神经保护作用,从而改善小鼠的抑郁样行为。2.岩藻多糖对酒精暴露小鼠发挥神经保护作用的机制可能与岩藻多糖改善小鼠肠黏膜屏障功能,恢复肠道微生物物种平衡,调节肠道-微生物-脑轴有关。