目的:本实验拟从线粒体自噬的角度,以阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)模型大鼠为研究对象,以Pink1/Parkin信号传导通路与认知功能关系为切入点,对逆灸改善阿尔茨海默病认知功能障碍的作用机理进行探讨,为临床防治AD提供一定理论依据和参考依据。方法:1.模型的制备:在脑立体定位仪下,用聚合态Aβ25-35(Amyloidbeta-peptide25-35)一次性注入大鼠双侧海马区制备AD模型。20%乌拉坦(2.5 mL/kg)注射麻醉大鼠后,将大鼠头部固定于脑立体定位仪上,使其前后独立,灭菌后切开头皮露出额头,定位海马区(前额后3.5 mm,两侧中线2.0 mm,硬膜下2.7 mm),用台式颅骨钻一小孔(直径1mm),将大鼠头部固定住,使大鼠头部呈正反面将微型进样器竖直插入,缓慢注入Aβ25-35,左右各注入1μm(5μg/μL),缓慢注入Aβ25-35,注入后留针5 min,使Aβ25-35充分渗透到局部组织中,再以1.0mm/min的速度缓慢抽出。术后马上对头皮进行缝合,术后5 d内,青霉素每日肌注10000 U/只。造模完毕后的第5 d,所有造模大鼠均作Morris水迷宫试验,剔除不合格者,按随机原则补充。2.分组和处理方法:将合格大鼠36只称重后按随机数字表法分为四组:逆灸组(9只):先对正常大鼠施于艾灸,每穴持续15 min,1次/d,6d/疗程,疗程间休息1天,共3个疗程。模型组(9只):正常喂食3周后按上述方法进行造模;造模后喂食1周,对所有指标进行测定。假手术组(9只):在双侧海马区分别注入等量的生理盐水,其余同模型组;正常组(9只):同时喂食,不做其他处理。3.艾灸方法:以余曙光主编的《实验针灸学》为基础,用特制小艾条,每穴15 min,1次/d,6d疗程,中间休息1天,共3个疗程,在正常大鼠的“百会”(顶骨正中)、“肾俞”(腰下两侧)、“足三里”(膝关节后外侧)上方进行悬灸。4.指标检测:水迷宫测试观察各组行为学差异;HE染色观察大鼠海马区神经元病理学改变;透射电镜观察海马区神经细胞超微结构变化;免疫荧光标记法检测海马区Beclin-1、LC3Ⅱ的阳性表达;Western blot法检测线粒体自噬通路PINK1/Parkin相关蛋白PINK1、Parkin相对表达值;采用荧光染料JC-1经流式细胞仪检测海马线粒体膜电位。结果:1.各组大鼠海马区行为学检测结果比较正常组和假手术组大鼠的运动轨迹明显较短,能快速找到水迷宫中的平台,逃避潜伏期时间和穿越平台次数不变,两组比较差异无统计学意义(P>0.05);与正常组比较,模型组大鼠逃避潜伏期时间延长,穿越平台次数减少,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,逆灸组大鼠逃避潜伏期时间缩短,穿越平台次数增加,差异有统计学意义(P<0.01)。2.各组大鼠海马区病理学比较2.1 HE染色观察各组大鼠海马区病理变化光镜下显示,正常组和假手术组海马区神经元排列紧密,细胞轮廓清晰、完整,未见明显变性、坏死等病理变化;模型组海马区神经元数量明显减少,细胞核固缩,核仁不清晰,核膜界限模糊;与模型组比较,逆灸组神经元数量有一定程度增多,细胞结构有所改善,但未完全恢复至正常水平。2.2各组大鼠海马区神经元超微结构比较正常组和假手术组神经元细胞核结构明显,核膜连续完整,胞浆内可见线粒体、高尔基体和内质网等细胞器,形态较完整且排列清晰,有髓神经纤维结构紧密;模型组神经元形态不规则,染色质增多并有轻微边集,胞浆基质溶解消失,空泡化严重,线粒体肿胀、线粒体嵴消失;逆灸组神经元病理改变减轻,细胞核基本趋于正常,核膜清晰,胞浆细胞器明显,内质网、线粒体可见轻微肿胀和嵴断裂,神经纤维轻微变性,未见其他明显变化。3.各组大鼠海马区PINK1、Parkin相对表达量的比较正常组与假手术组比较,PINK1、Parkin相对表达量无明显差异(P>0.05);与正常组比较,模型组PINK1、Parkin表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,逆灸组PINK1、Parkin表达量增高,差异有统计学意义(P<0.01)。4.各组PD0325901浓度大鼠海马CA1区Beclin-1、LC3Ⅱ阳性细胞表达比较正常组与假手术组比较,Beclin-1、LC3Ⅱ阳性表达细胞表达无明显差异(P>0.05);与正常组比较,模型组Beclin-1、LC3Ⅱ阳性细胞表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,逆灸组Beclin-1、LC3Ⅱ阳性表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。5.各组大鼠海马区PINK1、Parkin相对表达量的比较正常组与假手术组比较,PINK1、Parkin相对表达量无明显差异(P>0.05);与正常组比较,模型组PINK1、Parkin表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,逆灸组PINK1、Parkinbiomechanical analysis表达量增高,差异有统计学意义(P<0.01)Z-IETD-FMK配制。6.各组大鼠海马区线粒体膜电位结果比较正常组与假手术组比较,线粒体膜电位无明显差异(P>0.05);与正常组比较,模型组线粒体膜电位显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,逆灸组线粒体膜电位升高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论逆灸可预防和延缓AD的发生,其作用机制可能与逆灸激活PINK1/Parkin信号通路,调控Beclin-1、LC3Ⅱ因子表达,增强海马区线粒体自噬功能,改善神经元结构,进而提高认知功能有关。