研究背景和目的:幽门螺杆菌是一种可寄生在人体的胃组织的黏膜层的革兰氏染色阴性的微需氧菌,长期慢性的Hp感染可诱导胃上皮细胞炎症免疫微环境的形成,触发Correa级联反应模式并最终可发展为胃癌。幽门螺杆菌可以诱导的胃上皮细胞中活性氧(ROS)的产生,参与促进胃癌的发生。目前Hp感染仍然是危害人类健康的主要致病菌,研究Hp感染的具体致病机制对于Hp相关疾病的防治具有重大的意义。SUMO化修饰是一种类似于泛素化修饰的三级酶促级联反应,人体细胞的SUMO化修饰调节许多生物学过程,包括DNA损伤修复、免疫反应、致癌作用、细胞周期进展和细胞凋亡等。许多研究发现SUMO化修饰途径相关的酶在多种人类恶性肿瘤中都是高表达的,且SUMO分子可以与多种促癌蛋白结合加强其促癌的效应,SUMO化修饰的失衡与肿瘤的发展密切相关。SAE1是SUMO化修饰过程中唯一的E1激活酶的亚基,有研究表明SAE1在人类神经胶质瘤中高表达并且促进人类神经胶质瘤的进展,SAE1在肝细胞癌被认为是一种有前景的诊断癌症代谢的生物标志物。关于SAE1以及SUMO化修饰与胃癌的关系目前还并不十分清楚。SUMO化修饰的稳态受到许多环境和病理因素的影响。有研究表明,细菌病原体可以通过对宿主的SUMO化修饰途径进行干预,以确保成功感染。不同的细菌病原体在干预宿主的SUMO化修饰过程中,其靶向干预的环节也不同。这些干预导致了宿主细胞的蛋白质组和转录组的改变,也间接改变了宿主细胞正常的信号转导。Hp作为一种胃部的常见致病菌,其与SUMO化修饰的作用关系目前并不清楚。幽门螺杆菌可以诱导的胃上皮细胞中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的产生,有文献报道细胞内活性氧的水平会影响SUMO化修饰状态,而Hp是否可以通过ROS的途径影响细胞的SUMO化修饰水平也需要进一步探索。基于上述的研究背景,本研究从分子、细胞、组织三个层面探究SAE1及SUMO化修饰与Hp感染的关系及其在Hp相关的胃癌中的作用机制,为Hp相关疾病的的防治和靶向SUMO化修饰过程治疗肿瘤提供更多的理论依据。材料和方法:(一)SUMO分子与SUMO化修饰途径的酶在胃癌组织中的表达1.TIMER数据库分析SUMO分子以及SUMO化修饰的E1酶SAE1\SAE2、E2酶UBC9在多种人类恶性肿瘤中的m RNA表达;2.GEPIA数据库分析SUMO分子以及SUMO化修饰的E1酶SAE1\SAE2、E2酶UBC9在胃癌中的m RNA表达;3.免疫组化检测SUMO分子以及SUMO化修饰的E1酶SAE1\SAE2、E2酶UBC9在胃癌与正常胃组织中的蛋白质的表达。(二)Hp感染对SUMO分子与SUMO化修饰途径的酶的表达的影响。1.将Hp菌株PMSS1与GES-1和AGS细胞以不同感染复数和不同的感染时长进行共培养,Western blot检测SUMO1、SUMO2/3、SAE1、SAE2、UBC9的表达情况。2.采用ROS抑制剂NAC的不同浓度以不同的时长处理GES-1与AGS细胞,Western blot检测SUMO1、SUMO2/3、SAE1的表达。3.用不同浓度的过氧化氢处理细胞激发细胞活性氧后,Western blot检测SUMO1、SUMO2/3和SAE1的表达。4.设置阴性和阳性对照、单纯Hp感染组、Hp感染与NAC联合处理组,ROS检测试剂盒检测各组的ROS水平,Western blot检测各组的SUMO1、SUMO2/3和SAE1的表达。(三)SAE1对胃上皮细胞的生物学行为的影响1.构建敲减细胞SAE1的小干扰RNA,将si-SAE1转染AGS细胞后,采用CCK8实验检测对照组细胞与si-SAE1组细胞的增殖能力的差异。2.将si-SAE1转染AGS细胞后,采用平板克隆形成实验检测对照组细胞与si-SAE1组细胞的增殖能力的差异。3.将si-SAE1转染AGS细3-Methyladenine体外胞后,采用Transwell细胞迁移与侵袭实验检测对照组细胞与si-SAE1组细胞的细胞迁移与侵袭能力的差异。4.将si-SAE1转染AGS细胞后,Western blot检测胃上皮间质转化(EMT)相关蛋白的表达差异。(四)SAE1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学行为的影响1.将si-SAE1转染AGS细胞后再加Hp菌株PMSS1感染细胞,采用CCK8实验检测各组的增殖能力的差异。2.将si-SAE1转染AGS细胞后,采用平板克隆形成实验检测各组细胞的增殖能力的差异。3.将si-SAE1转染AGS细胞后,采用Transwell细胞迁移与侵袭实验检测各组细胞的迁移与侵袭能力的差异4.将si-SAE1转染AGS细胞后,提取各组细胞的全细胞裂解液,Western blot检测EMT相关指标的变化,(五)SAE1在胃癌组织中的表达情况及其患者的临床信息的关系1.TCGA数据库分析SAE1在胃癌与正常胃组织中m RNA表达及其与患者生存期的关系。2.免疫组化检测了含有93对胃癌与癌旁正常组织的胃癌组织芯片中的SAE1的表达,将SAE1在胃癌组织芯片的表达情况与患者的临床信息进行相关性的统计分析。结果:(一)SUMO分子与SUMO化修饰途径的酶在胃癌组织中的表达1.TIMER数据库分析显示SUMO分子以及SUMO化修饰的E1酶SAE1\SAE2、E2酶UBC9在多种人类恶性肿瘤中的m RNA表达相对正常组织都是升高的(P<0.05);2.GEPIA数据库PLX5622研究购买分析显示SUMO1(P<0.05)、SUMO2(P<0.05)以及SUMO化修饰的E1酶SAE1\SAE2、E2酶UBC9(P<0.05)在胃癌中的m RNA表达相对正常组织都是升高的;3.免疫组化结果表明SUMO分子以及SUMO化修饰的E1酶SAE1\SAE2、E2酶UBC9在胃癌相比正常胃组织中的蛋白质的表达都是升高的(P<0.05)。(二)Hp感染对SUMO分子与SUMO化修饰途径的酶的表达的影响。1.将Hp菌株PMSS1与GES-1和AGS细胞以不同感染复数和不同的感染时长进行共培养,Western blot显示Hp感染可以显著上调SUMO1、SUMO2/3、SAE1的表达(P<0.05),对SAE2、UBC9的表达无明显作用。2.采用ROS抑制剂NAC的不同浓度以不同的时长处理GES-1与AGS细胞,Western blot显示NAC可以显著抑制SUMO1、SUMO2/3、SAE1的表达(P<0.05)。3.用不同浓度的过氧化氢处理细胞激发细胞活性氧后,Western blot显示过氧化氢可以显著上调SUMO1、SUMO2/3和SAE1的表达(P<0.05)。4.设置阴性和阳性对照、单纯Hp感染组、Hp感染与NAC联合处理组,ROS检测试剂盒检测各组的ROS水平,Hp感染可以显著上调细胞的ROS水平(P<0.05),过氧化氢溶液显著激发细胞内的ROS(P<0.05),NAC可以显著抑制Hp诱发细胞产生的ROS(P<0.05),Western blot显示Hp感染显著上调细胞的SUMO1、SUMO2/3和SAE1表达(P<0.05),NAC可以显著抑制Hp诱导的SUMO1、SUMO2/3和SAE1的上调(P<0.05)。(三)SAE1对胃上皮细胞的生物学行为的影响1.构建敲减细胞SAE1的小干扰RNA,Western blot显示si-SAE1显著敲低AGS细胞的SAE1的表达(P<0.05),将si-SAE1转染AGS细胞后,CCK8实验表明si-SAE1组细胞相比对照组细胞的增殖能力减弱(P<0.05)。2.将si-SAE1转染AGS细胞后,平板克隆形成实验表明si-SAE1组细胞相比对照组细胞的增殖能力减弱(P<0.05)。3.将si-SAE1转染AGS细胞后,Transwell细胞迁移与侵袭实验表明si-SAE1组细胞相比对照组细胞的细胞迁移与侵袭能力减弱(P<0.05)。4.将si-SAE1转染AGS细胞后,Western blot显示胃上皮间质转化(EMT)相关蛋白的表达下降(P<0.05),具体表现为Vimentin、ZEB1下调,E-cadherin上调。(四)SAE1对H.pylori感Autoimmune blistering disease染的胃上皮细胞生物学行为的影响1.将si-SAE1转染AGS细胞后再加Hp菌株PMSS1感染细胞,CCK8实验结果表明si-SAE1可以显著抑制Hp促进胃上皮细胞的增殖能力(P<0.05)。2.将si-SAE1转染AGS细胞后,平板克隆形成实验结果表明si-SAE1可以显著抑制Hp促进胃上皮细胞的增殖能力(P<0.05)。3.将si-SAE1转染AGS细胞后,Transwell细胞迁移与侵袭实验结果表明siSAE1可以显著抑制Hp促进胃上皮细胞的迁移与侵袭能力(P<0.05)。4.将si-SAE1转染AGS细胞后,提取各组细胞的全细胞裂解液,Western blot结果表明si-SAE1可以显著抑制Hp促进胃上皮细胞的EMT相关指标的上调(P<0.05)。(五)SAE1在胃癌组织中的表达情况及其患者的临床信息的关系1.TCGA数据库分析SAE1在胃癌相对正常胃组织的m RNA高表达(P=0.001),高表达的SAE1与患者不良预后相关。2.免疫组化结果表明胃癌组织芯片中SAE1在胃癌组织相对于癌旁正常组织高表达,将SAE1在胃癌组织芯片的表达情况与患者的临床信息进行相关性的统计分析发现SAE1在胃癌组织中高表达(P<0.0001),高表达SAE1与患者的TNM分期(P=0.029)和脉管侵犯(P=0.029)具有显著相关性,SAE1高表达组的总体生存期比SAE1低表达组更差。结论:1.SUMO分子与SUMO化修饰途径的E1酶SAE1/SAE2、E2酶UBC9在胃癌组织中高表达。2.Hp感染可以通过ROS途径上调胃上皮细胞内SAE1及SUMO1、SUMO2/3的表达,对SAE2、UBC9的表达无明显效应。3.敲减胃上皮细胞的SAE1的表达可以显著抑制Hp促进的胃上皮细胞的增殖、迁移、侵袭能力和EMT表型。4.SAE1在人胃癌组织中高表达并与患者的不良预后相关。