【目的】现有研究表明尿道里有定植微生物菌群,尿道微生态Liver immune enzymes紊乱与肾结石、肾移植、慢性肾病等多种泌尿系统疾病有关。IgA肾病(Immunoglobulin A Nephropathy,IgAN)是慢性肾病中最常见的原发性肾小球疾病,肠道、扁桃体微生态已被报道与IgAN的发生发展有关,但IgAN的尿液微生态特征尚不清楚,特别是其与疾病的进展是否相关有待研究。本研究拟采用16s r RNA基因测序研究IgAN患者的尿液微生态特征,并结合血液和尿液代谢组和肾脏组织蛋白质组的“多组学”方法分析IgAN患者的尿道微生态与疾病进展之间的相互关系,筛选可能的作用机制,以揭示尿液微生态与IgAN进展之间的关系。同时本研究拟利用微生物组和代谢组筛选与疾病进展相关的潜在生物标记物。【方法】1.收集2022年6月至2022年10月就诊于昆明医科大学第一附属医院、云南省第一人民医院、昆明市延安医院肾脏内科进行肾活检手术的IgAN患者作为IgAN组,根据IgAN病理分级分为IgANⅡ级、IgANⅢ级、ColforsinIgANⅣ级、IgANⅤ级,招募健康体检门诊的健康志愿者作为对照组。收集所有研究对象的清洁中段尿液样本、血清样本和IgAN患者肾活检组织样本分装并保存在-80℃条件下待用。收集研究对象的临床资料和临床检验数据。2.利用16s r RNA基因测序对尿液细菌中编码核糖体小亚基的V3-V4可变区基因进行扩增测序,并通过α多样性和β多样性探讨不同分级的IgAN患者和健康对照组的尿液微生物菌群的丰富度和多样性特征。并通过LEf Se(Linear discriminant analysis Effect Size,LEf Se)分析和秩和检验来探讨IgAN与健康对照组的差异菌群。3.采用非靶向性代谢组(Untargeted Metabolomics)分析IgAN患者和健康对照组的血液和尿液代谢组特征,利用主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)分析不同分级的IgAN患者与对照组的差异代谢物。根据单因素方差分析的统计检验P value值,正交-偏最小二乘判别分析(Orthogonal projections to latent Structures discriminant analysis,OPLS-DA)计算的变量投影重要度(Variable Importance for the Projection,VIP),组间差异倍数(fold change,FC)筛选差异代谢物,将VIP>1且p<0.05的代谢物作为组间差异代谢物,并对差异代谢物进行溯源分析,筛选微生物来源的代谢物。4.选取VIP值最大的四种血尿和尿液代谢物绘制受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic,ROC),分析代谢物在不同分级患者的诊断效能,再将筛选得到的差异菌群和差异代谢物的相对丰度根据R语言的random Forest 4.6构建随机森林模型,绘制了随机森林模型的操作特征曲线(ROC),并使用p ROC包计算曲线下面积(AUC)来评估模型的性能。5.利用4D-Fast DIA蛋白定量的方法检测IgAN患者肾活检组织的蛋白,选取表达量变化倍数>1.5倍(FC>1.5或FC<0.67),且T检验后p value<0.05的蛋白作为差异蛋白,并通过生物信息学分析对差异蛋白进行基因本体(Gene Ontology,GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析,分析差异蛋白的相关功能。6.利用多组学数据联合分析分析尿液微生物与IgAN进展的相关性,使用Met Origin平台的deep Met Origin Analysis分析模式进行微生物与微生物来源的代谢物的相关性分析(样本一一对应),并绘制热图和相关网络图,筛选重要的微生物与代谢物,再根据斯皮尔曼相关性分析分析差异代谢物与差异蛋白的相关性,筛选相关性最强的信号通路,得到尿道微生物与IgAN进展的相关的可能的信号通路。【结果】1.通过性别、年龄及BMI的匹配后,总共招募到100例患者,其中IgANⅡ-Ⅴ级的患者每组20例,匹配的健康对照组20例。收集100个研究对象血液和尿液样本各100例,IgAN患者肾活检组织样本10例,其中Ⅱ级3例,Ⅲ级7例。2.尿液微生物组分析发现,α多样性分析的Shannon、Simpson、pielou指数在对照组和IgAN患者中没有统计学差异,但IgAN-Ⅲ级的ACE指数和Chao1指数、Observe species指数均比对照组和IgAN-Ⅴ级患者高(p值<0.05),而β多样性分析发现IgAN患者和健康对照组的距离较远,表明样本间菌群群落差异性大。尿液微生物物种相对丰度分析发现在门水平上,IgAN患者和健康对照组的优势菌在门水平上基本相同,主要包括变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门。在属水平上,IgAN患者和健康对照组的优势菌属种类也基本相同,丰度最高的为嗜盐单胞菌属。通过秩和检验筛选发现组间具有差异的菌属有34种,IgAN组与对照组相比肠球菌属、肠杆菌科、大消化链球菌属、定会杆菌属、g-Schleiferia、厌氧球菌属、鞘氨醇单胞菌科SD04E11菌属、消化链球菌属、乳酸链球菌属、韦荣氏球菌属、葡萄球菌属、气单孢菌属、乳酸杆菌增多。3.通过代谢组分析发现不同分级的IgAN组的不饱和脂肪酸和游离氨基酸与健康对照组相比明显增多,且与疾病病理分级呈正相关。其中在尿液代谢物分析中发现244种差异代谢物,在血液代谢代谢物分析中发现100种差异代谢物,对代谢物进行溯源分析,发现了代谢物中存在多种肾毒性毒素,如吲哚-3-乙酸酯、吲哚乙酸、异戊酸等。4.经过ROC曲线分析,发现血液和尿液中VIP值最大的BLZ945分子量4种代谢物对不同分级的IgAN患者均有一定的鉴别诊断价值,可能与疾病的进展相关。经过随机森林模型的建立,发现血液中的血液中的脱氧胆酸、甘氨醇酸、9,10-环氧十八碳烯酸、2-乙酰丁酸,和尿液中的前列腺素E1表现出最佳性能,5种代谢物可能是与疾病进展相关的潜在标志物。5.通过IgAN患者的活检组织的蛋白组学分析,最终筛选出82个差异蛋白,其中53个上调蛋白,29个下调蛋白,生物信息富集分析发现差异蛋白富集最显著的信号通路是氧化磷酸化。6.通过多组学关联分析我们筛选了可能与IgAN进展相关信号通路,其中肠球菌-二甲基甘氨酸-血小板因子4相关性最强,另外,L-甲硫氨酸在血液和尿液组间代谢物检测中均具有统计学差异,且与健康对照组富集的菌呈正相关,表明IgAN患者体内L-甲硫氨酸的抗氧化作用减弱,可能与IgAN进展有关。【结论】1.IgAN患者存在尿液菌群紊乱,肠球菌属、肠杆菌科、大消化链球菌属、定会杆菌属、g-Schleiferia、厌氧球菌属、鞘氨醇单胞菌科SD04E11菌属、消化链球菌属、乳酸链球菌属、韦荣氏球菌属、葡萄球菌属、气单孢菌属、乳酸杆菌增多。2.多组学关联分析发现肠球菌-二甲基甘氨酸-血小板因子4可能是与IgAN进展相关性最强的信号通路。3.随机森林筛选的脱氧胆酸、甘氨醇酸、9,10-环氧十八碳烯酸、2-乙酰丁酸,和尿液中的前列腺素E1对预测IgAN进展有一定价值。