蛋白赖氨酸乙酰化修饰在物种中广泛分布,参与蛋白质翻译、转录复制、新陈代谢、信号转导等多个重要的生物学过程,该修饰调控的分子机制是当前生物大分子修饰机理研究的热点问题。一方面,蛋白可以通过酶促或者非酶的化学反应将蛋白赖氨酸残基进行乙酰化修饰;另一方面,蛋白需要特异的赖氨酸去乙酰化酶(KDACs)对乙酰化修饰蛋白的功能进行可逆调控。目前,细菌中已确定功能的KDACs均与真核同源,包括Zn~(2+)依赖型Rp Lda(与II型KDACs同源)、Zn~(2+)依赖型Acu C(与I型同源)以及NAD~+依赖型Sirtuins(与III型同源)3种,是否还有其他类型的KDACs目前尚不可知。不同物种中蛋白赖氨酸乙酰化修饰的位点多达上百至数千个,而当前已知的细菌去乙酰化酶种类明显与修饰底物数量相差甚远,细菌内很可能还有一些未知的KDACs对特异的蛋白底物起作用以维持细胞的正常生理功能。因此,寻找新的细菌蛋白赖氨酸去乙酰化酶,研究其分子调控机制与其功能,是当前蛋白质乙酰化修饰调控领域一个重要研究内容之一。本论文以在水产养殖业中引起鱼类爆发SB431542说明书性流行病感染的人-畜-鱼共患重要病原菌嗜水气单胞菌为研究材料,发现该菌的Cob Q蛋白(Ah Cob Q,Uniport ID A0KI27,基因名AHA＿1389)是一类不依赖于Zn~(2+)、NAD~+以及ATP的去乙酰化酶,该蛋白与当前已知的所有KDACs没有同源性,且只在原核生物中存在,是一类新鉴定的去乙酰化酶。主要研究内容如下;(1)构建了ahcob Q缺失菌株,以野生型及经典去乙酰化酶ahcob B基因缺失菌株为对照,对ahcob Q突变株全菌蛋白的乙酰化修饰水平进行检测。结果发现,Δahcob Q与Δahcob B均能引起全菌蛋白乙酰化修饰水平升高,初步怀疑Ah Cob Q是去乙酰化酶;(Mercury bioaccumulation2)生物信息学分析发现Ah Cob Q由一个NTPase的domain(4-179aa)和一个未知功能区域(180-265aa)组成。同源比对分析发现该蛋白与目前已知的KDACs没有同源性,且在真核生物中没有同源蛋白,提示Ah Cob Q可能是一类新型KDAC;(3)对缺失菌生理表型的检测发现,缺失ahcob B后细菌生物被膜生成能力增强,而Δahcob Q则显著提高细菌运动能力以及铁离子利用能力、减弱生物被膜生成能力,两者对细菌生理表型的影响有显著不同;(4)通过体外去乙酰化修饰实验,发现Ah Cob Q可以在体外不依赖Zn~(2+)、NAD~+以及ATP对乙酰化修饰BSA蛋白(Kac-BSA)进行去乙酰化修饰,并可能依赖铁离子执行去乙酰化酶功能;(5)合成乙酰化修饰肽段,利用质谱技术确认Ah Cob Q确实可以将合成的乙酰化修饰肽段去乙酰化,从而排除其可能是水解酶的可能性;(6)利用定点突变等分子生物学技术手段确定Ah Cob Q的去乙酰化酶活性区域在195-245aa的未知功能区域内,并发现L196为Ah Cob Q关键酶活性位点之一。以上结果说明Ah Cob Q不需要依赖Zn~(2+)与NAD~+辅助就可以显著地去除Kac-BSA乙酰化修饰,且与目前已知的去乙酰化酶没有明显的同源性,是一类新的去乙酰基化修饰酶。(7)为进一步确认Ah Cob Q蛋白的去乙酰化酶活性及其生物学功能,本论文利用定量修饰蛋白质组学技术手段,比较ahcob B、ahacu C和ahcob Q分别缺失后,其乙酰化修饰蛋白底物及修饰位点的异同,结果发现Ah Cob Q共调控47个修饰蛋白的52个乙酰化修饰位点发生上调变化,其中与Ah Cob B共同调控的位点6个,与Ah Acu C共同修饰位点9个,三个蛋白共同调控的修饰位点共4个;(8)生物信息学分析发现,Ah Cob Q主要影响能量代谢以及转录翻译相关蛋白的乙酰化修饰变化;(9)通过蛋白定点乙酰化修饰和Western blotting等方法,发现Ah Cob Q确实可以在体外将上述乙酰化修饰底物蛋白去乙修饰。值得注意的是,Ah Cob Q不仅可以单独去除特定位点的乙酰化修饰,还可以与其他KDACs合作,共同调控同一个蛋白不同修饰位点或者相同位点的去乙酰化修饰;(10)进一步通过酶活测定实验发现,Ah Cob Q可以去除TCA循环中限速酶-异柠檬酸脱氢酶ICD的K388位点的乙酰化修饰,增强酶活性,从而参与细菌能量代谢的调控过程;(11)最后,通过缺失菌的斑马鱼攻毒实验发现,Ah Cob Q参与嗜水气单胞菌毒力的调控。进一步利用酶活测定与竞争ELISA技术手段,发现Ah Cob Q并不影响细菌毒力因子-烯醇化酶ENO的代谢酶活性,但可以通过去除ENO K195位点乙酰化修饰,增强ENO与人源纤溶酶原(PLG)的相互作用,提示Ah Cob Q可能通过正调控ENO-PLG之间的相互作用,促进病原菌降解破坏宿主细胞外基质进入胞内,从而入侵宿主。综上所述,本论文发现Ah Cob Q是一种新型去乙酰化酶,可以调控多种关键酶的活性,影响细菌的能量代谢、转录翻译与细菌毒力等多个生物学过程;同时确定了Ah Cob Q的活性区域与活性位点,提出调控细菌乙酰化修饰蛋白的分子新机制。以上研究拓展了对细菌去乙酰化酶的种类和依赖类型的认识,加深了对细菌蛋白乙酰化修饰如何调控蛋白的代谢与入侵宿主等重要生物学功能的理解,为更好地研STM2457究细菌如何通过调控蛋白的功能,适应外界环境变化并保持细菌生态位的动态平衡提供了新的方向,并为防治该致病菌的感染提供新的靶标与思路。