研究背景脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)引发神经系统运动及其他生理功能障碍。目前尚无可行、有效的治疗手段。因此,深入研究并揭示脊髓损伤的病理生理机制,寻找thyroid autoimmune disease减轻脊髓损伤、促进修复的特异性干预靶点,是神经科学领域急需攻克的重要医学科学问题。小胶质细胞是中枢神经系统的固有免疫细胞,在神经系统内环境稳态维持、抗感染免疫、神经系统损伤修复过程中发挥重要作用。但是小胶质细胞在SCI后炎症反应和组织修复中具体作用及分子机制亟需阐明。MS4A6C(人MS4A6A的鼠同系物),是4次跨膜结构域膜分子MS4A基因家族成员,研究表明,MS4A6C主要表达于小胶质细胞等免疫细胞膜表面。在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型,单细胞RNA测序和分子生物学验证实验均表明MS4A6C在小胶质细胞表达显著上调,提示其在小胶质细胞介导的神经系统炎症反应中可能发挥重要作用,但脊髓损伤条件下,小胶质细胞膜MS4A6C表达的时空特征尚不清楚,小胶质细胞膜MS4A6C在脊髓损伤后炎症反应及组织修复中的具体作用及分子机制如何?深入研究这些重要的科学问题有助于阐明小胶质细胞在SCI中的生物学作用,有望发现能够减轻脊髓损伤、促进修复的特异性干预靶点,具有重要的生物学意义和临床应用价值。研究目的:1.明确脊髓损伤病理条件下,小胶质细胞膜MS4A6C表达的时间变化和空间定位特征。2.明确MS4A6C敲低对脂多糖诱导的小胶质细胞炎症反应的影响及机制。3.转录组测序分析并验证MS4A6C调节小胶质细胞炎症反应可能分子机制。研究内容:1.MS4A6C多肽抗原免疫后血清效价分析及小鼠脊髓组织对抗体进行验证;8周龄C57BL/6J雄性小鼠,行脊髓损伤手术,术后第3天、第7天和第14天处死小鼠,用于Q-PCR,Western Blotting检测MS4A6C的表达;免疫荧光检测脊髓损伤后局部IBA-1~+-MS4A6C~+小胶质细胞。2.BV2小胶质细胞脂多糖刺激后Q-PCR检测6h、12h和24h MS4A家族其它成员和MS4A6C的表达;MS4A6C慢病毒感染BV2小胶质细胞的条件摸索;脂多糖刺激BV2小胶质细胞浓度的摸索;Q-PCR检测MS4A6C敲低后小胶质细胞炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达。3.小胶质细胞LV3-NC+LPS组和LV3-MS4A6C-660+LPS组进行转录组测序,进行测序数据质控总览,参考基因组比对区域分布,基因表达水平分析,差异表达基因上下调频数统计,差异基因表达水平火山图分析,差异表达基因聚类分析和差异表达基因GO功能与KEGG通路注释;Q-PCR方法检测差异表达基因GDF15、Ube2L3、Zfand3、Med6、gbp2。研究结果:1.8周龄C57BL/6Dolutegravir分子量J雄性小鼠,成功建立脊髓损伤模型,并且损伤局部炎症因子表达水平明显增加;小鼠经MS4A6C多肽抗原5次免疫,取血,ELISA方法测定血清效价,所有小鼠血清效价均≥32K,其中以M01,M05号小鼠血清及组织抗体验证效果最佳;脊髓损伤后小鼠MS4A6C m RNA水平呈上升趋势,显著高于其对照小鼠;同样MS4A6C蛋白水平在脊髓损伤后3d升高;免疫荧光实验显示脊髓损伤后局部IBA-1~+FGFR抑制剂-MS4A6C~+小胶质细胞浸润明显。2.LPS刺激后BV2小胶质细胞MS4A家族成员表达均发生改变。其中MS4A6C随着LPS刺激的时间增加,在MS4A家族成员中呈现先升高后降低的趋势,在12h时与对照相比,升高7倍,在LPS刺激后的MS4A家族成员中升高倍数最高;50 MOI慢病毒感染BV2小胶质细胞48h,LPS 50ng/m L刺激12h后,MS4A6C基因敲低约60%-70%,与处理对照相比达到显著性水平;BV2小胶质细胞敲低MS4A6C基因后,能减轻炎症反应,TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平下降。3.转录组测序共构建了8个测序文库,包括4个LV3-NC+LPS组和4个LV3-MS4A6C-660+LPS组链特异性文库;链特异性文库文库获得398814810条高质量测序数据;经质控分析后,Q20%、Q30%和GC含量也都满足后续分析要求,且质量较高;经过比对,大多数都测序数据主要比对到Exon区;比较LV3-NC+LPS组和LV3-MS4A6C-660+LPS组发现,140个基因上调,29个基因下调;GO富集分析表明差异表达基因涉及细胞质、细胞膜、细胞外间隙、胞外区、蛋白质结合、金属离子结合和钙离子结合等;KEGG通路富集分析表明差异表达基因涉及细胞外基质受体相互作用、粘着斑、感染等通路富集。研究结论:1.脊髓损伤局部MS4A6C m RNA和蛋白表达均上调,MS4A6C~++IBA-1~+小胶质细胞在脊髓损伤局部的浸润显著增加。2.MS4A6C敲低可减轻脂多糖(LPS)诱导的BV2小胶质细胞炎症反应,降低炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平。3.转录组测序表明MS4A6C调控BV2小胶质细胞炎症反应,MS4A6C敲低引起细胞外基质互作、组织修复功能相关的基因差异性表达及通路富集改变。