目的:针对卡比孜胶囊(SLZ)治疗溃疡性结肠炎(UC)的临床疗效显著,结合UC的主要症状:结肠黏膜病变、肠功能、炎症反应、免疫等环节,建立不同模型,采用UC、炎症等模型综合评价SLZ抗UC药效;在此基础上,采用非靶向代谢组学分析差异代谢物;借助16S r RNA基因测序的手段,探索SLZ对UC模型大鼠肠道菌群调节作用;应用网络药理学筛选其抗UC作用靶点,并通过动物实验进行验证,基于网络药理学建立“活性成分-疾病-作用靶点”之间的相互联系,探索其药效物质基础和作用机制;分析差异代谢物、菌群变化与网络靶点筛选结果之间的关系,多维度解析SLZ抗UC作用及药理机制。此外采用斑马鱼肠道炎症模型和蛋白降解实验,考察SLZ主要化学成分抗UC疗效及机制,为SLZ新药质量控制提供依据,为SLZ临床应用及新药研究提供支撑。方法:(1)结肠黏膜改善:大鼠局部灌胃三硝基苯磺酸(TNBS)制备UC模型和葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导大鼠UC模型,进行疾病活动指数(DAI)评分,检测血清中相关炎症等因子,观察结肠长度、重量及损伤程度,进行结肠大体形态和病理学损伤评分;(2)小肠功能:番泻叶诱导小鼠腹泻,观察小鼠腹泻及便稀等级,以及SLZ对小鼠小肠墨汁推进率的影响;(3)抗炎:二甲苯制备小鼠耳肿胀模型、大鼠棉球肉芽肿组织增生模型以及血管通透性模型,检测耳肿胀度、肿胀率、肉芽重量以及血管透过液吸光度值,分析抗炎效果;(4)免疫调节:采用CCK-8法考察SLZ对小鼠T、B细胞增殖反应的影响;(5)利用~1H-NMR非靶标代谢组学技术检测大鼠结肠样品,通过主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)获取代谢轮廓,筛选差异代谢物;(6)采用16S r RNA测序检测UC大鼠粪便,通过Alpha和Beta多样性分析,获取各组大鼠肠道微生物群落组内及组间的相似度信息,评价SLZ对肠道菌群的影响;(7)采用超高效液相色谱与四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS/MS)联用技术鉴定SLZ中的化学成分,使用TCMSP数据库和Swiss数据库进行候选成分及靶点筛选,通过PPI、GO及KEGG分析,确定SLZ抗UC的潜在靶点及物质基础;进一步采用Elisa、Western Blot、RT-q PCR以及免疫组化法检测相关细胞因子、基因及蛋白表达,验证网络药理学预测结果;HPLC法检测4种成分的含量;(8)采用HEK293T细胞进行NLRP3转染,通过蛋白泛素化检测,考察鞣花酸降解NLRP3蛋白的途径;制备TNBS诱导斑马鱼肠炎模型,检测肠道荧光数量、肠道蠕动情况以及病理情况,考察并验证没食子酸、间双没食子酸、没食子酸甲酯抗UC作用及机制。结果:(1)与模型组比较,SLZ中、高剂量可明显降低TNBS和DSS诱导的UC模型大鼠的DAI指数,血清IL-1、IL-6、TNF-α、Ig G、NO、MDA、OFR含量明显降低,SOD、EGF含量明显升高,能明显改善结肠粘膜固有层淋巴、单核细胞呈散在或小灶性浸润等病理表现(P<0.05,P<0.01);(2)SLZ能够明显降低腹泻小鼠的稀便等级和腹泻指数,且能够降低小鼠小肠墨汁推进率,表明SLZ能够抑制肠推进功能(P<0.05,P<0.01);(3)SLZ高剂量能够降低二甲苯致小鼠的耳肿胀度及肿胀率,及大鼠肉芽重量,并显著降低小鼠血管通透性(P<0.05,P<0.01);(4)与Con A对照组比较,SLZ能够抑制Con A诱导T细胞增殖和LPS诱导的B细胞增殖(P<0.05,P<0.01);(5)非靶标代谢组学结果显示,UC模型大鼠给予SLZ后,差Fetal medicine异代谢物苯丙氨酰甘氨酸、L-丝氨酸、D-葡萄糖醛酸等多种代谢物的水平发生变化,同时对嘧啶代谢、氰基氨基酸代谢等11条代谢通路产生影响;(6)Alpha多样性分析结果SLZ能够增加了Lachnospiraceae＿NK4A136＿group菌和Muribaculaceae菌等有益菌的相对丰度;Beta多样性分析结果,模型组与其他组之间群落差异较大。UP-GMA聚类树结果,SLZ组除Negativicutes、链球菌属细菌的丰度高外,其他均与空白组无差异;(7)UPLC-QTOF-MS/MS分析鉴定出46种化合物,网络药理学筛选得到4个候选成分及其87个药物靶selleckchem点和UC的4755个疾病靶点,SLZ治疗UC的靶点涉及NOD样受体、NF-κB、Toll样受体等信号通路;分子对接结果显示没食子酸、没食子酸甲酯、间AM-2282细胞培养双没食子酸和鞣花酸等4个候选成分与IL-1β、ASC、Caspase-1、TLR4、LC3-II和NLRP3蛋白受体结合能均较高,并通过分子生物学实验得到了验证;UC大鼠结肠组织ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1和NLRP3的表达较正常组显著增加,经SLZ治疗后,UC大鼠结肠组织ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1和NLRP3表达显著减少,提示SLZ可抑制UC大鼠结肠组织NLRP3信号通路的激活;中、高剂量的SLZ能够显著抑制UC大鼠结肠部位TLR4、IL-1R和P-IKB的表达,且TLR4的m RNA表达水平也受到了抑制。UC模型组大鼠结肠部位caspase-1和LC3Ⅱm RNA水平显著升高,ASC、NLRP3、Caspase-1以及LC3Ⅰ蛋白表达显著增加,经SLZ治疗后,LC3Ⅱm RNA水平以及LC3Ⅰ蛋白表达均显著下降,其趋势与SLZ抗炎结果相一致。且SLZ能够显著抑制NEK7的水平。(8)没食子酸、没食子酸甲酯和间双没食子酸对斑马鱼肠道炎症有显著的抑制效果,且呈现浓度依赖性;没食子酸甲酯、间双没食子酸能够显著抑制肠道蠕动;病理结果显示3种化合物均能改善炎性细胞浸润情况,并且不同程度的抑制NLRP3等炎症因子的表达。结论:SLZ能够明显改善TNBS、DSS诱导的大鼠UC模型结肠粘膜炎症等病理表现和小肠推进功能,对非特异性炎症模型有明显的抑制作用,且具有一定的免疫调节和抗氧化作用。SLZ能够参与氨基酸代谢和能量代谢,增加肠道有益菌,减少致病菌落,调控UC大鼠肠道菌群失调。作用机制上,氨基酸代谢能够调节NOD样受体、NF-κB、Toll样受体、AMPK等信号通路,与网络药理学筛选结果一致,促进有益菌的增加能够缓解UC炎症状态下的能量消耗;通过抑制TLR/IL-1R途径和NF-κB通路,阻止NLRP3炎性小体激活,有效控制炎症反应;通过调节细胞自噬,阻止NLRP3炎症小体的组装、激活,从而抑制炎症反应;同时SLZ能够显著抑制NEK7的水平,从而影响NLRP3的信号转导,抑制小体活化,最终达到治疗UC的目的。没食子酸、没食子酸甲酯、间双没食子酸以及鞣花酸是SLZ抗UC的物质基础。