1材料
动 物 6 ～ 8 周 龄 雄 性 SD 大 鼠 ， 体 质 量( 200 ± 20) g，由兰州大学动物实验中心提供。动物许可证号: SCXK( 甘) 2018 － 0002。本实验经兰州大学第一医院伦理委员会批准。
试剂 Ｒho 激酶抑制剂 Y27632，购 自美国APExBIO公司; D － 乳酸( D － lactate，D － Lac) 试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司; 抗 ＲOCK1 抗体，购自伟博鑫生物技术有限公司; 抗磷酸化肌球蛋白轻链( Phosphorylated myosin light chain，p － MLC) 抗体，购
自北京博奥森公司; 抗闭锁小带蛋白 － 1 ( Zonula occludens，ZO － 1) 抗体和抗 Occludin 抗体，均购自塞维尔生物科技有限公司。PD0325901说明书
仪器 酶标仪，德国 Leica 公司产品; 120KV 生物透射电子显微镜，捷克 FEI 公司产品。
2实验方法
2. 1 模型构建、分组与给药方法
参照文献［7］构建脓毒症大鼠模型，所有大鼠术后立即液体复苏。
将24 只大鼠随机分为假手术组、Y27632 对照组、模型组、实验组，每组 8 只。Y27632 对照组和实验组术前 15 min 腹腔注射 Y27632 溶液 5 mg·kg － 1［8］，假手术组和模型组在上述时间点腹腔注射等量 PBS 溶液。Y27632 溶液的配置方法: 将粉末状 Y27632 溶解到 PBS 溶液中，配置成 1. 67 g·L － 1 的溶液，置于 － 20
℃ 冰箱避光保存，备用。
2. 2 样本采集
造模 24 h 后心脏取血 1 mL，置于 EDTA 抗凝管，静置 30 min，以 3 000 r· min － 1 离心 10 min，取上清液，置于 － 80 ℃ 冰箱备用。安乐死大鼠后，取回盲瓣2 cm 处小肠组织，10% 中性甲醛固定，后续进行病理学观察和免疫组化，部分小肠组织，2. 5% 戊二醛固定，进行超微结构观察。
2. 3 以苏木精 － 伊红( HE) 染色观察小肠组织病理变化并进行 Chiu 评分［9］
取甲醛固定的小肠组织，包埋，切片，HE 染色，封片，光学显微镜下观察小肠组织形态学改变。Chiu 氏分级评价小肠黏膜损伤情况，分值为 0 ～ 5 分，评分越
高表示损伤越重。
2. 4 以透射电镜 ( Transmission electron micro- scope，TEM) 法观察肠上皮细胞超微结构［10］确认细节
取戊二醛固定的小肠组织，1% 四氧化锇再固定;梯度乙醇脱水; 包埋、切片; 铀染、铅染双重染色，置于透射电镜下观察。
2. 5 以 ELISA 法测定血清 D － 乳酸含量［11］
取上清液，用 ELISA 法检测 D － 乳酸水平，具体操作参考试剂盒说明书进行。
2. 6 以 免 疫 组 化 法 检 测 小 肠 组 织 ＲOCK1 、p － MLC、ZO － 1 和 Occludin 的表达水平［12］
取甲醛固定的小肠组织，包埋，切片。加入兔抗鼠 ＲOCK1 多克隆抗体 ( 稀释度 1 ∶ 60 ) 、兔 抗鼠p － MLC多克隆抗体( 稀释度 1 ∶ 400 ) 、兔抗鼠 ZO － 1 多克隆抗体( 稀释度 1 ∶ 400) 、兔抗鼠 Occludin 多克隆抗体( 稀释度 1∶ 500) ，4 ℃ 过夜，滴加山羊兔二抗( 稀释度 1∶ 100) ; DAB 显色，过蒸馏水，苏木精复染，脱水透明后封片，光镜下观察小肠组织并用 Image － ProPlus 6. 0 图像分析软件，计算平均光密度值。Navitoclax
3统计学处理
用 SPSS 20. 0 软件进行数据分析。计量资料用xˉ± s表示，多组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较用 LSD t 检验。