牛白血病病毒(Bovine leukemia virus,BLV)属于逆转录病毒科丁型反转录病毒属,主要感染外周血淋巴细胞和单核细胞,引起牛淋巴细胞的持续增殖,由于无明显临床症状而被人们所忽略。然而,在全球范围内BLV流行率呈上升趋势,且尚无一款商品化的BLV疫苗研制成功。因此亟需研究和发现一些可降低BLV前病毒载量(Proviral load,PVL)的化合物以控制BLV感染和传播。前列腺素E_2(Prostaglandin E_2,PGE_2)是一种通过环氧合酶-2(Cyclooxygenase enzyme 2,COX-2)代谢花生四烯酸产生的炎症介质。相关研究表明,在病毒感染期间,机体会分泌产生PGE_2。PGE_2具有免疫抑制作用,可通过众多途径促进病毒感染期间的免疫逃避。同时,PGE_2还参与和调控病毒复制,而使用COX-2抑制剂减少PGE_2合成可在体外和体内激活宿主抗病毒免疫反应。因此,COX-2抑制剂是潜在的治疗慢性感染性疾病的新方法。然而,PGE_2是否参与BLV感染目前还不清楚。因此,本研究的目的在于分析PGE_2与BLV PVL的关系,明确PGE_2对奶牛免疫功能和BLV复制的影响,以便为治疗奶牛BLV感染提供新的策略,同时为降低BLV传播风险和维护奶牛免疫系统健康提供试验依据。本研究采集了黑龙江省某规模化牧场107头泌乳奶牛的血液。首先,通过ELISA筛选BLV阳性牛,再通过绝对定量PCR对BLV阳性牛样本进行BLV PVL检测,将病毒拷贝数>1 000 copies/10 ng DNA定义为高载量(High proviral load,H-PVL),反之则为低载量(Low proviral load,L-PVL)。同时,通过全自动血常规分析仪检测BLV阳性奶牛血液中淋巴细胞数,以进行相关性分析。结果表明,107头奶牛中,21头奶牛的BLV抗体检测呈阳性,阳性率为19.62%,其中H-PVL奶牛数量为5头,L-PVL奶牛数量为16头,BLV PVL与抗体滴度和淋巴细胞计数之间均呈显著正相关性(r=0.66,P<0.01和r=0.88,P<0.01)。为了探究PGE_2与BLV前病毒载量的关系。首先,通过ELISA分别检测健康奶牛、L-PVL奶牛和H-PVL奶牛血清中PGE_2浓度,并分析其与淋巴细胞计数和BLV PVL之间的相关性,再通过密度梯LY-188011采购度离心法分离奶牛外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),通过q RT-PCR检测3组奶牛PBMC的EP2、EP4和HPGD m RNA转录水平。最后,分析BLV PVL及PGE_2浓度与HPGD m RNA转录水平的相关性。结果表明,与健康奶牛相比,H-PVL奶牛体内PGE_2浓度升高(P<0.01),PGE_2浓度与BLV PVL和淋巴细胞数呈正相关性(r=0.54,P<0.01和r=0.63,P<0.01)。L-PVL和H-PVL奶牛PBMC的EP2 m RNA转录水平均上调(P<0.01和P<0.05),H-PVL奶牛PBMC的EP4m RNA转录水平上调(P<0.01),HPGD m RNA转录购买Smoothened Agonist水平下调(P<0.01)。HPGD m RNA转录水平与PVL和PGE_2浓度呈负相关性(r=-0.54,P<0.05和r=-0.55,P<0.05)。上述结果表明,PGE_2的产生和传导信号的增强与BLV前病毒载量密切相关。为了探究PGE_2对PBMC功能和BLV复制的影响。首先,将健康奶牛与BLV阳性牛PBMC分别与BLV抗原(BLV Ag)共孵育,通过ELISA和q RT-PCR检测上清PGE_2浓度和PBMC的COX-2 m RNA转录水平。接着,将不同浓度的PGE_2与健康奶牛PBMPlants medicinalC共孵育,CCK-8法检测PBMC增殖,q RT-PCR检测PBMC细胞因子及免疫抑制分子m RNA转录水平。最后,将BLV阳性牛PBMC分别与PGE_2、EP2激动剂和EP4激动剂共孵育,通过q RT-PCR和Western blot分别检测BLV基因转录和蛋白表达水平。结果表明,BLV Ag刺激可显著上调BLV阳性奶牛PBMC的COX-2 m RNA转录水平,并显著促进PGE_2产生(P<0.01),但对健康奶牛PBMC无影响;与对照组相比,500 n M PGE_2能抑制PBMC增殖(P<0.01),显著下调IL-2(P<0.05)、IFN-γ(P<0.01)和TNF-α(P<0.01)并上调IL-10、PD-L1和Tim-3的m RNA转录水平(P<0.01);PGE_2和EP2及EP4激动剂均能促进BLV-gp51和BLV-p24的m RNA转录和蛋白表达水平(P<0.01)。上述结果表明,PGE_2对奶牛PBMC免疫功能具有抑制作用,PGE_2通过与EP2和EP4结合激活下游信号通路促进BLV复制。为了探究体外COX-2抑制剂对PBMC功能的调节作用和BLV复制的体外影响及其作用途径。将BLV阳性牛PBMC与美洛昔康共孵育。CCK-8法检测PBMC增殖,q RT-PCR检测PBMC细胞因子、免疫抑制分子、COX-2、BLV-gp51和BLV-p24 m RNA转录水平,Western blot检测COX-2、EP2、EP4、BLV-gp51、BLV-p24及cAMP/PKA/CREB通路相关蛋白表达水平。结果表明,体外美洛昔康能促进PBMC增殖(P<0.01),显著上调IL-2、IFN-γ和TNF-α(P<0.01)并显著下调IL-10、PD-L1、Tim-3、COX-2、BLV-gp51和BLV-p24的m RNA转录水平(P<0.01),抑制COX-2、EP2和EP4蛋白表达(P<0.01),并抑制PKA和CREB磷酸化(P<0.01),最终抑制了BLV-gp51和BLV-p24蛋白表达(P<0.001)。上述结果表明,美洛昔康在体外能够激活BLV特异性Th1反应,阻断COX-2/PGE_2通路,下调EP2和EP4受体表达,阻断cAMP/PKA/CREB通路,从而抑制BLV复制。为了探究COX-2抑制剂对降低奶牛体内BLV PVL的治疗效果,本研究选取5头H-PVL奶牛用于COX-2抑制剂美洛昔康、氟尼辛葡甲胺和鱼腥草挥发油的临床研究。注射周期为每周注射1次,共5次,注射剂量分别为:美洛昔康0.5 mg/kg、氟尼辛葡甲胺2.5 mg/kg和鱼腥草注射液120 m L/次。于第0、7、14、21、28、35和第70天采集样本,并进行BLV PVL、细胞因子转录和分泌及免疫抑制分子转录水平检测。结果表明,美洛昔康注射期间能有低奶牛体内BLV PVL(P<0.05),促进Th1细胞因子分泌(P<0.05),抑制Th2细胞因子分泌(P<0.05),但对IL-4分泌无明显影响。同时能够下调PD-L1和Tim-3的m RNA转录水平(P<0.05),细胞因子在PBMC中的m RNA转录水平变化与其在奶牛体内的分泌水平变化基本趋于一致。氟尼辛葡甲胺同样表现出了抗病毒活性,但其对降低BLV PVL、诱导Th1免疫反应及下调免疫抑制分子m RNA转录水平均弱于美洛昔康。鱼腥草挥发油同样能够显著降低奶牛体内BLV PVL(P<0.05),治疗效果介于美洛昔康和氟尼辛葡甲胺之间。此外,鱼腥草挥发油还能够降低炎性细胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的分泌水平,减轻奶牛机体炎症水平。上述结果表明,3种COX-2抑制剂均有降低奶牛体内BLV PVL的作用,是潜在的控制BLV感染和降低BLV传播风险的商品化药物。综上所述,PGE_2与BLV PVL存在显著正相关性,PGE_2对奶牛PBMC免疫功能具有抑制作用,并通过与EP2和EP4结合激活下游信号通路促进BLV复制。在体外实验中,COX-2抑制剂阻断COX-2/PGE_2,下调EP2和EP4受体表达,阻断cAMP/PKA/CREB通路,抑制BLV复制。临床研究表明,COX-2抑制剂在临床研究中能降低奶牛体内BLV PVL,是潜在的控制BLV感染和降低BLV传播风险的商品化药物。