背景:放射治疗是肿瘤治疗的基石之一。在肿瘤的全程管理中,约50%-70%的恶性肿瘤患者需要放射治疗的介入,其中接近一半的患者以根治性放疗为目的。放射治疗主要通过电离辐射(Ionizing radiation,IR)的形式诱导肿瘤细胞DNA损伤进而发挥抗肿瘤效应。IR介导的DNA损伤可分为直接损伤和间接损伤。直接损伤即射线通过光子直接攻击DNA分子导致的DNA损伤,约占放疗介导的总体DNA损伤的20%-30%;间接损伤即IR首先作用于细胞内水分子使其发生电离作用并形成一系列氧自由基,后者继而作用于DNA分子导致的氧化性DNA损伤,约占放疗介导的总体DNA损伤的70%-80%。因此,放疗介导的DNA损伤大部分是氧化性损伤。氧化性损伤的特征是包含一系列不同类型的DNA损伤形式。根据不同损伤之间的距离,大致可将氧化性损伤分为孤立型损伤和成簇型损伤。孤立型损伤主要包括单个的异常碱基损伤、无碱基位点(又称为AP位点)以及单链断裂(Single strand break,SSB)等。由于互补的DNA链上存在完整的模版,因此孤立型损伤可以被相对应的修复模式精准修复,不会对基因组的完整性造成威胁。与之相反,成簇型损伤又被称为复杂型损D-Lin-MC3-DMA伤,由不同类型且距离较近(通常定义为10bp以内)的孤立型损伤构成。由于损伤组成形式复杂,细胞内缺乏与之对应的修复模式,目前机体对成簇型损伤的修复机制仍不清楚。深入研究成簇型损伤的修复机制,有助于为设计新的治疗策略和增加肿瘤细胞对放疗的敏感性提供新的思路。在IR介导的各种DNA损伤形式中,AP位点这种损伤形式尤其值得关注。其一,IR可以直接攻击DNA分子产生AP位点;其二,IR可通过氧自由基作用于DNA分子造成异常碱基修饰,后者经过DNA糖基化酶处理后亦可以形成AP位点。因此,AP位点是IR作用后DNA损伤的重要组成部分。碱基切除修复(Base eEpstein-Barr virus infectionxcision repair,BER)通路是修复孤立AP位点的主要通路。脱嘌呤/脱嘧啶脱氧核糖核酸内切酶1(Apurinic/apyrimidinic endo-deoxyribonuclease 1,APE1)是该通路中启动AP位点修复的关键限速酶。APE1通过识别孤立AP位点并在其DNA骨架的5’端进行切割,产生一个SSB的中间产物,进而促进BER通路下游信号分子的招募,完成对该孤立型损伤的修复。本课题组长期致力于研究DNA损伤修复对多个肿瘤生物学行为的影响及其相关分子机制,特别对APE1在肿瘤发生发展以及耐药中的作用进行了广泛的探索。APE1是高等真核生物细胞中发挥核酸内切酶活性的主要分子,其行使胞内约95%的核酸内切酶活性,在维持基因组的稳定性等方面发挥着不可或缺的作用。既往我们通过分子病理实验证明了APE1在多种肿瘤组织中高表达,并与肿瘤的恶性程度相关。同时,国内外同行的研究亦表明APE1表达升高与肿瘤细胞对治疗的抵抗相关。因此,APE1被认为是一种极具前景的抗肿瘤分子靶点。目前,针对孤立AP位点的修复已经比较清楚。然而,APE1是否参与伴有AP位点的成簇型损伤的修复以及相关的修复机制目前仍不清楚。理论上,如果成簇型损伤中两个相邻损伤病灶包含AP位点,且二者位于相对DNA链上时,APE1能够识别并切割这两个邻近病灶中的AP位点,并诱导一个DNA双链断裂(Double strand break,DSB)的中间产物生成。DSB是细胞内最致命的DNA损伤类型,是决定肿瘤细胞对放射治疗敏感性的关键因素。因此,如果APE1可将成簇型损伤转化为DSB,那么APE1活性增高应该可以增加肿瘤细胞对放射治疗的敏感性。然而,既往多项研究显示,APE1参与促进放射治疗的抵抗,与该假设相悖。综上所述,IR作用后,APE1在修复成簇型损伤中还存在不确定的、未被揭示的复杂功能。本研究旨在探索IR等氧化性损伤作用后,APE1是否会通过对成簇型损伤中AP位点的处理参与DSB的形成和修复以及相关分子机制,以期为克服肿瘤对放射治疗的抵抗提供新的思路。方法:1.APE1促进IR作用后早期时相DSB的形成:使用慢病毒介导的sh RNA在人宫颈癌细胞系(He La和Si Ha)中建立APE1敲低阴性对照(APE1 Negative control,APE1NC)细胞株和APE1敲低(APE1 Knock down,APE1 KD)细胞株。利用时间梯度和剂量梯度的免疫印迹实验检测IR作用后0-8小时内,APE1对DSB分子标记物—γH2AX激活的影响。利用彗星实验测量IR作用后1小时APE1对SSB和DSB产量的影响。通过APE1的小分子抑制剂预处理细胞,使用免疫印迹实验检测APE1的核酸内切酶活性和www.selleck.cn/products/Docetaxel(Taxotere)氧化还原调节活性对IR作用后1小时γH2AX激活的影响。2.APE1介导的早期时相DSB经历了有效的修复:利用克隆形成实验检测IR作用后APE1对细胞生存的影响。利用微核形成实验评估APE1在IR作用后对基因组不稳定性的影响。利用大跨度时间梯度的免疫印迹实验检测IR作用后APE1对γH2AX激活的影响,以评估APE1介导的早期时相DSB的修复进程。使用叔丁基过氧化氢(Tert-butyl hydroperoxide,TBHP)模拟IR介导的氧化性损伤,通过时间梯度的免疫荧光和彗星实验检测APE1在TBHP作用后对DSB形成和修复的影响。3.APE1通过激活非同源末端连接(Non-homologous end-joining,NHEJ)通路促进早期时相DSB的修复:在IR和TBHP作用后,利用免疫印迹和免疫共沉淀实验检测APE1对DNA损伤反应(DNA damage response,DDR)通路关键激酶DNA-PK_(cs)和ATM激活的影响。通过免疫荧光检测53BP1核焦点的动态变化和染色质成分分离实验检测NHEJ通路关键蛋白在染色质上的募集差异,评估APE1在氧化性损伤后对NHEJ通路激活的影响。4.APE1通过维持NHEJ通路中Artemis蛋白的稳定性促进宫颈癌细胞对氧化性损伤的抵抗:通过q RT-PCR实验检测APE1对Artemis m RNA表达水平的影响。利用免疫印迹实验检测APE1对Artemis蛋白表达和稳定性的影响。通过免疫共沉淀检测APE1对Artemis泛素化的影响。使用免疫组化评估宫颈癌临床样本中APE1和Artemis蛋白表达的相关性,以及二者与宫颈癌根治性放化疗后疗效的关系。5.联合抑制APE1和DDR激酶的活性可在氧化性损伤后发挥协同增敏作用:通过体外细胞实验和体内移植瘤模型分析在IR等氧化性损伤作用后,联合抑制APE1和DDR关键激酶ATM的活性,对宫颈癌细胞凋亡和移植瘤生长的影响。结果1.APE1促进IR作用后早期时相DSB的形成:在IR作用后早期时相(约1小时内),相比于APE1 KD细胞,APE1 NC细胞内γH2AX的激活水平和DSB的产量明显较高。抑制APE1的氧化还原活性不影响γH2AX的激活水平,抑制APE1的核酸内切酶活性可以显著降低γH2AX的激活水平。2.APE1介导的早期时相DSB经历了有效的修复:克隆形成实验结果显示APE1促进了宫颈癌细胞对IR的抵抗。微核形成实验结果显示IR作用后,上述APE1介导的早期时相DSB在修复96小时后并未转化为更多的微核。DSB修复进程分析显示,与IR和TBHP作用后1小时相比,APE1 NC细胞内DSB水平在IR和TBHP作用后24小时显著降低,而APE1 KD细胞内DSB水平在IR和TBHP作用后24小时显著升高。以上结果说明APE1介导的早期时相DSB经历了有效的修复。3.APE1通过激活NHEJ通路促进DSB的修复:在IR和TBHP作用后,APE1显著促进了NHEJ通路关键激酶DNA-PK_(cs)的激活。APE1显著促进了NHEJ通路核心分子Ku70、Ku80、DNA-PK_(cs)、Artemis、DNA Ligase 4向染色质的募集。APE1显著促进了53BP1核焦点在DSB损伤位点的形成。4.APE1通过维持NHEJ通路中Artemis蛋白的稳定性促进宫颈癌细胞对氧化性损伤的抵抗:在APE1敲低的宫颈癌细胞和基因鼠中,Artemis的蛋白表达水平显著降低,但m RNA水平不受影响。敲低APE1导致Artemis泛素化水平升高,抑制蛋白酶体活性可以明显恢复Artemis蛋白在APE1 KD细胞中的表达。同时APE1和Artemis的蛋白表达在宫颈癌患者的临床样本中具有强烈的正相关性(相关系数=0.747,P<0.01)。Artemis的蛋白表达水平与行根治性放化疗宫颈癌患者的疗效相关,Artemis高表达和低表达患者的中位生存时间是47个月对比24个月(P=0.002)。在APE1 KD细胞中回补Artemis可以部分挽救敲低APE1对氧化性损伤的敏感性。5.联合抑制APE1和DDR激酶的活性可在氧化性损伤后发挥协同增敏作用:体内细胞实验和体外移植瘤实验显示在氧化性损伤作用下,联合抑制APE1和ATM活性可显著增加细胞的凋亡水平和抑制移植瘤的生长。结论1.APE1通过其核酸内切酶活性及时促进成簇型损伤向DSB转化的过程,是为NHEJ通路提供可识别的DSB末端的关键步骤,后者进而激活NHEJ修复通路,导致肿瘤细胞对IR的抵抗。2.APE1通过维持Artemis蛋白的稳定性促进NHEJ通路对DSB的修复。3.敲低APE1导致大量复制相关的晚期时相DSB的累积,联合抑制APE1和DDR关键激酶ATM可在IR等氧化性损伤作用下发挥协同增敏作用。