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西瓜是一种重要的园艺植物，近年来饱受病毒病危害。为明确西瓜病毒病害病原，对采自山西太谷区表现花叶、皱缩等症状的西瓜叶片进行小RNA深度测序，同时利用RT-PCR的方法并结合生物信息学的手段，综合分析造成西瓜花叶、皱缩症状的病毒病原。结果表明，表现皱缩、花叶症状的西瓜样品被瓜类蚜传黄化病毒（cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV）、甜瓜潜隐病毒（cucumis melo cryptic virus,CmCV）、西瓜病毒A(watermelon virus A,WVA)、西瓜皱叶病毒2号（watermelon crinkle leaf-associated virus2,WCLaV2）和黄瓜绿斑驳花叶病毒（cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）5种病毒复合侵染。利用RT-PCR的方法分别扩增获得5种病毒的外壳蛋白（coat protein, cp）基因序列，进一步通过序列相似性分析和系统进化分析发现，本研究获得的西瓜CABYV分离物CABYV-SXJZ(GeneBank登录号：OP957280)核苷酸序列与中国南瓜CABYV分离物InnerMongolia(GeneBIACS-10759抑制剂ank登录号：EU262627)的核苷酸序列相似性最高，达到100%；西瓜WVA分离物WVA-SXJZ(GeneBank登录号：OP957281)核苷酸序列与同样来自中国瓠瓜WVA分离物WVA-Huizhou(GeneBank登录号：MK292710)和西瓜WVA分离物WVA-KF15(GeneBank登录号：KY363796)核苷酸序列相似性最高，分FG-4592浓度别达到93.6%%和99.9%;WCLaV2分离物WCLaV2-SXJZ(GeneBank登录号：OP957282)核苷酸序列与WCLaV2巴西西瓜分离物Ju-01(GeneBank登录号：LC636075)核苷酸序列相似性性最高，达到99.6%；本研究首次从西瓜上获得的CmCV分离物CmCV-SXJZ(GeneBank登录号：OP957283)核苷酸序列与中国甜瓜分离物CmCV-HLJ(GeneBank登录号：MH479773)的核苷酸相似性高达99.9%；本研究获得的CGMMV分离物CGMMV-SXJZ(GeneBank登录号：OP957284)核苷酸序列与CGMMV分离物GDLZ(GeneBank登录号：MK933286)、CG038(GeneBank登录号：MH271443)、CGMMV-pXT1(GeneBank登录号：KY753929)、e WT(GeneBank登录号：KY753928)、C284R(GeneBank登录号：KY753927)、CGMMV-XG(GeneBank登录号：KP868654)、JD2(GeneBank登录号：KM873785)和Anhui(GeneBank登录号：KTprotamine nanomedicine236095)核苷酸序列相似性最高，均达到99.8%。

目的 观察丹皮酚是否能够影响巨噬细胞M1极化。方法 用Toll样受体7/8激动药雷西莫特(R848)刺激RAW264.7细胞建立M1型巨噬细胞模型。将细胞分为对照组、模型组、高剂量实验组。对照组细胞正常培养；模型组用2μg·mL~(-1)的R848处理24 h,高剂量实验组用2μg·mL~(-1)R848和30μmol·L~Recipient-derived Immune Effector Cells(-1)丹皮酚处理24 h。以酶联免疫吸附(ELISA)法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分泌水平；以流式细胞术检测CD80阳性表达的巨噬细胞比例；以实时荧光定量多聚核苷酸链反应(Q-PCR)检测TNF-α、白细胞介素-1β(IL-1β)mRNA的表达水平；以蛋白质印迹法检测iNOS蛋白表达情况。结果 高剂量丹皮酚干预R848诱导的M1极化24 h后，对照组、模型组和高剂量实验组上清中TNF-α水平分别为(355.55±16.45)、(552.69±18.09)和(447.71±22.71)ng·L~(-1);CD80阳性细胞比例分别为(16.29±0.50)%、(43.57±3.78)%和(36.08±1.40)%;IL-1β mRNA表达水平分别为1.04±0.15、60.02±12.92和34.69±1.75;TNF-α mRNA表达水平分别为1.00±0.04、13.69±0.25和12.20±0.46;iNOS蛋白表达水平分别为1.00±0.00、1.11±0.05和0.91±0.0Decitabine供应商3。模型组上述指标与对照组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05);高剂量实验组上述指标与模型组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 丹皮更多酚能够抑制R848诱导的巨噬细胞M1极化。

研究背景及目的骨折固定及假体植入已广泛应用于骨科植入物手术中,但因其无法抵抗微生物感染,而导致植入物相关感染的发生。我军海外基地、舰艇编队在执行远海作战任务时,大多数外伤伤部集中在四肢骨盆,伤员后送难度大,精确手术开展非常困难,由于远海作战伤员得不到及时有效的救治、后送困难,致残致死率高,严重影响作战和演训任务的顺利进行,并给伤员的伤后生活带来巨大的痛苦。对于四肢骨盆骨折,一期以外支架螺钉临时稳定骨折后修复软组织、二期更换髓内钉或锁定钢板的分Vorinostat浓度期治疗策略已被人们广泛接受。但外固定螺钉钉道感染和螺钉松动对二次手术转换时机以及外支架治疗的时限有很大影响。加上前线医疗条件差、设备简陋,战场恶劣环境也导致伤口极其易受感染。与骨科植入物相关的感染引起的过度炎症反应、进行性骨溶解和持续的细菌负荷,抑制了感染时的骨愈合。传统全身输注抗菌药物抗感染治疗可导致耐药性且副作用大,同时并不能抑制骨吸收和调节巨噬细胞炎症反应。为了改善细菌感染时的骨愈合,理想的治疗方法不仅要在局部清除细菌,还要促进骨修复、抑制炎症和骨溶解。因此,研制出一种具有抗感染、促进骨修复并抑制骨溶解和炎症的多功能生物材料,对骨科临床及我军一线战伤抗感染救治有重要的意义。近些年,通过对骨科植入物表面纳米结构改性或应用纳米载体来运送抗菌药物到给感染部位来增强局部抗菌效果越来越引起各国学者的关注。介孔二氧化硅纳米颗粒因其可控的孔径、高表面积、可调节的表面功能化、优良的化学稳定性和孔隙性质,成为生物医学等多领域的研究热点。本研究的目的是通过共价固定骨形态发生蛋白4的介孔二氧化硅纳米颗粒并负载依诺沙星来制备一种多功能纳米载药颗粒,具有良好的生物相容性和缓释药物的功能,用于局部抗菌、抑制炎症和骨溶解。同时,通过体内、外实验验证骨形态发生蛋白4/依诺沙星修饰介孔二氧化硅纳米颗粒的抗菌性能、抑制炎症和骨溶解能力。研究方法利用ABT-199溶胶-凝胶法制备介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs),并在氨化的介孔二氧化硅纳米颗粒表面共价接枝骨形态发生蛋白4(BMP4)以及在介孔二氧化硅纳米颗粒孔隙中负载依诺沙星(EN)。随后应用扫描电子显微镜(SEM)以及透射电子显微镜(TEM)观察涂层表面结构。所有样品通过超声分散在无水乙醇中后,使用纳米粒度分析仪测量纳米颗粒的分散性。通过药物释放实验研究介孔二氧化硅/骨形态发生蛋白4/依诺沙星纳米颗粒(MSNs-BMP4-EN)药物释放能力。通过体外抑菌实验测定MSNs-BMP4-EN纳米颗粒最低抑菌浓度(MIC)并记录其对金黄色葡萄球菌的生长曲线,并利用细菌活性实验、细菌涂板定量实验和活/死细菌染色实验来评估MSNs-BMP4-EN的体外抗菌性能。通过体外细胞毒性实验(CCK-8法)来探究纳米颗粒对大鼠骨髓间充质干细胞(r BMSCs)增殖的影响。通过碱性磷酸酶(ALP)染色及定量实验、胶原染色及定量实验、茜素红(ARS)染色及定量实验以及大鼠的成骨分化标志物基因RNA定量分析、蛋白质印迹分析,研究MSNs-BMP4-EN对r BMSCs成骨分化的影响。利用抗酒石酸磷酸酶(TRAP)染色、破骨相关标志物基因RNdrug-resistant tuberculosis infectionA定量分析和骨吸收实验,评估MSNs-BMP4-EN对破骨分化的影响。利用Sanger测序、酶联免疫吸附试验(ELISA)炎症相关标志物基因RNA定量分析,评估MSNs-BMP4-EN对感染状态下局部炎症免疫的影响。通过构建大鼠股骨骨缺损模型,进行体内抗感染实验及体内成骨实验,利用micro-CT分析、微生物学分析、组织切片和Van Gieson染色等多种实验方法评估MSNs-BMP4-EN在体内的抗感染、成骨能力。研究结果利用SEM和TEM对纳米颗粒进行了分析,证实了成功合成了所需的MSNsBMP4-EN纳米复合材料,其呈粒径约50 nm的均匀球形、表面有许多均匀分布的孔洞。粒径分析仪显示三种纳米粒子在无水乙醇中分别形成直径分别为210.7 nm、220.7 nm和187.4 nm的粒子团。依诺沙星在吸光度286nm处有一个特征峰,浓度与吸光度呈良好的线性关系。其包封率和载药量分别为43.25%和30.10%。药物释放实验显示MSNs-BMP4-EN纳米颗粒具有较高的药物释放率,在12小时内爆发释放依诺沙星后可持续缓释5天。在第5天时依诺沙星的累积释放率为67.4%。体外抑菌实验证实,MSNs-BMP4-EN可显著抑制金黄色葡萄球菌的黏附和增殖。体外细胞毒性实验和成骨分化相关实验表明,MSNs-BMP4-EN可促进r BMSCs增殖及早期、晚期成骨分化。体外破骨分化相关实验表明,MSNs-BMP4-EN可阻止早期破骨细胞的形成、抑制骨溶解。体外炎症相关实验表明,MSNs-BMP4-EN可抑制小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)分泌炎症因子,从而改变免疫微环境,有利于成骨分化和细胞外基质矿化。动物体内实验表明,MSNs-BMP4-EN可有效抑制金黄色葡萄球菌感染并抑制感染时的巨噬细胞炎症反应和细菌导致的骨溶解,最终促进骨感染条件下的骨愈合。研究结论MSNs-BMP4-EN纳米复合材料具有制备方法简单、成本低、高载药量、较久的缓释性能及良好的生物相容性等优点。这些实验表明MSNs-BMP4-EN具有优良的抗菌和抗炎特性,并能在植入物感染的早期阶段抑制骨吸收,从而进一步促进骨愈合。因此,这种具有多种生物功能的纳米复合材料在治疗骨感染方面具有良好的临床应用前景,未来有望转化为临床骨科植入物涂层或手术部位植入药物,并对我军一线战伤抗感染救治有重要的意义。

化学动力学疗法(CDT)利用肿瘤细胞内源性H_2O_2与芬顿催化剂反应生成高毒性的羟基自由基(·OH),从而杀死肿瘤细胞,但内源性H_2O_2不足和纳米粒子转运效率较低导致抗癌效果不理想。本研ABT-199小鼠究制备了一种分散性良好、尺寸较小的铜掺杂介孔二氧化硅(Cu-MSN),负载化疗药物阿霉素(DOX)和抗坏血酸盐(AA)后,表面经叶酸(FA)和二甲基马来酸酐(DMMA)改性的壳聚糖(FA-CS-DMMA)以及羧甲基壳聚糖(CMC)包裹,得到pH响应型靶向纳米催化剂FA-CS-DMMA/CMC@Cu-MSN@DOX/AA(缩写为FCimmune cytolytic activityDC@Cu-MSN@DA)NSC 127716。扫描电镜显示纳米粒子FCDC@Cu-MSN@DA粒径约为100nm。体外48h内Cu~(2+)释放量可达80%,药物DOX释放达到57.3%。释放的AA经自氧化后产生H_2O_2,诱导Cu~(2+)发生类芬顿反应,从而增强CDT。细胞实验证明, FCDC@Cu-MSN@DA联合化疗药物表现出优异的抗肿瘤活性,说明该多功能纳米催化剂在癌症治疗中具有潜在应用前景。

研究背景与目的:胰腺激肽酶是一种具有改善微循环作用的血管扩张剂,目前主要用于糖尿病引起的早期肾病。胰激肽原酶肠溶片生物利用度低,为提高其生物利用度,本课题在胰激肽原酶中SAHA作用加入了促渗透剂SNAC,对SNAC的合成工艺进行了研究,并利用Caco-2细胞模型对SNAC促胰激肽原酶的吸收效果进行了评价,确定SNAC与胰激肽原酶的较佳比例,并将SANC与胰激肽原酶混合制备成肠溶胶囊,进行胰激肽原酶在大鼠体内的药代动力学考察,为二类新药的开发奠定基础。方法:通过对SNAC合成的相关专利及文献资料研究,明确了合成SNAC的起始原料,并从安全、经济、绿色等角度出发,考察了相关反应步骤的反应溶剂、辅料用量、反应温度、反应时间以及后处理等,并从产品收率、生产成本、工业化可行性等方面综合考虑优选SNAC合成工艺。利用Caco-2细胞模型对SNAC促胰激肽原酶的吸收效果进行研究。首先利用CCK-8法,进行SNAC和胰激肽原酶对Caco-2细胞的短期毒性的测定;将Caco-2细胞接种到Transwell小室上,进行为期21 d的模型建立,同步进行Caco-2细胞形态学观察、Caco-2细胞单层跨膜电阻、碱性磷酸酶活性、苯酚红通透性等细胞模型评价;模型建立成功后,在Transwell小室上进行SNAC对胰激肽原酶的转运考察,进行了5个比例、为期2 h的考察;最后将每个时间点的转运液利用胰激肽原酶ELISA试剂盒进行胰激肽原酶含量的测定。根据胰激肽原酶肠溶片成人日用量,换算成大鼠一次胰激肽原酶的剂量。利用玛瑙研钵将含SANC的胰激肽原酶和不含SANC的胰激肽原酶进行研磨,测定胰激肽原酶的均一性后,根据效价进行每粒胶囊的装填,然后进行肠溶包衣。利用ELISA试剂盒进行了胰激肽原酶在大鼠空白血浆中的方法学考察;最后进行含SANC与不含SNAC胰激肽原酶肠溶胶囊在大鼠体内的药代动力学研究。结果:1.查阅相关专利和文献,并进行工艺探索,SNAC的合成路线为:首先合成1,3-苯并噁嗪-2,4(3HBelumosudil小鼠)-二酮,即中间体1,以水杨酰胺为原料,以1.2个当量的CDI为缩合剂,THF为反应溶剂,该步反应产物收率达93.5%;其次,合成中间体2,以三乙胺为碱,8-溴辛酸乙酯先加1.1 eq,随着反应再加入0.1 eq,反应体系在55-65℃下,反应时间6-10 h,得到固体后,再用甲叔醚?正庚烷=1?5进行打浆纯化,产物收率在94.9%,降低了生产成本;然后,合成中间体8-(2-羟基苯甲酰氨基)辛酸,以氢氧化钠为开环试剂,反应体系在90-95℃下,反应3-4 h,反应效果较好,产物收率为94.0%;最后,合成SNAC,一步成盐反应,将中间体8-(2-羟基苯甲酰氨基)辛酸用异丙醇溶解,加入4倍水溶解的氢氧化钠,降温析晶,过滤时用异丙醇淋洗,60℃干燥14-20 h,得到最终产物SNAC,收率可达90.8%。2.利用CCK-8法进行Caco-2细胞短期毒性试验,SNAC和胰激肽原酶对Caco-2细胞活性较好的浓度分别不高于1000μg/m L和1200μg/m L。用倒置显微镜观察Caco-2细胞在Transwell上的细胞形态,发现其铺满后多成铺路石状,呈现很好地连接状态;随着培养天数增加,Caco-2细胞单层跨膜电阻TEER值逐渐增加,待第21 d时,TEER值升至976.5Ω*cm~2;随着细胞培养的时间天数的持续增加,细胞在AP侧中与其在BL侧细胞中的碱性磷酸酶酶活力比值出现显著性的加大,这一个结果证明出了APK在其AP侧表达,并因此也证明出现了极化情况,待21d时,AP/BP大于3时,说明Caco-2细胞极化及分化完成;利用苯酚红试验测定21 d时Caco-2细胞的通透性,其表观渗透系数Papp值为7.06×10~(-8)cm/s,小于标准值1×10~(-6)cm/s,进一步地确认了Caco-2细胞的完整性。成功建立Caco-2细胞模型后,进行了胰激酶的SNAC转运实验,加入SNAC?胰激肽原酶=32?1、16?1、8?1、4?1、2?1的实验组中,胰激肽原酶的累积透过量显著高于无SNAC的对照组,加入SNAC的胰激肽原酶累积透过率分别为13.574%、7.597%、10.653%、3.755%、2.523%,且使胰激肽原酶累积透过量分别提高了14.50%、9.50%、26.8%、5.27%、3.9%,累积透过率最高的是SNAC?胰激肽原酶=32?1,且提高的累积透过量也较高。3.根据成人胰激肽原酶肠溶片日用量换算成大鼠为15 U/只;测定胰激肽原酶混合粉末均一性,不含SNAC和含SNAC的胰激肽原酶效价均值分别为1.58、0.87U/mg,RSD分别为5.31%、3.04%,均小于10%。胰激肽原酶在大鼠空白血浆的中专属性考察:胰激肽原酶标准液与含标准品血浆的OD值接近,空白血浆与空白孔对照的OD值接近,表明空白血浆和空白孔均对胰激肽原酶的测定没有干扰;胰激肽原酶检测的质量浓度线性范围为75～1200 ng/L;回收率考察1000、500、100 ng/L的含标准品血浆的中的RSD分别为0.561%、0.813%、2.354%(n=3),且均小于5%,符合试验要求;连续测定3 d,精密度考察1000、500、100 ng/L的含标准品血浆的批内RSD分别为5.01%、3.04%、3.77%(n=3),批间RSD分别为4.39%、3.47%、4.19%(n=9),RSD结果均小于10%,符合试验要求;测1、3、7 d胰激肽原酶-20℃下保存,4℃冰箱缓慢融解的RSD分别为3.14%、7.36%、8.24%(n=9),均小于10%,证明胰激肽原酶在此条件下的稳定性较好。大鼠体内的药代动力学研究结果表明,含SANC胰激肽原酶肠溶胶囊中的胰激肽原酶在大鼠体内的药代动力学AUC_Medical incident reporting(0-12 h)为5679.747 ng/L*h、t_(1/2)为4.569 h;不含SANC胰激肽原酶肠溶胶囊中的胰激肽原酶在大鼠体内的药代动力学AUC_(0-12 h)为4639.665 ng/L*h、t_(1/2)为3.13 h;加入SNAC后,AUC提高了22%;C_(max)也高于不含SANC的胰激肽原酶肠溶胶囊组。结论:研究确定了一条低成本、绿色安全、适合工业化生产的SNAC合成路线,证实了SNAC对胰激肽原酶的促吸收效果,明确SNAC与胰激肽原酶较佳的比例为32?1,为今后开发胰激肽原酶新型口服二类新药打下基础。

减毒沙门氏菌VNP20009是一种应用范围较广的天然来源溶瘤细菌,基于其已证实的临床安全性、可特异性趋化靶向肿瘤和明确已知的基因组序列等优点而被广泛用于抗肿瘤biocultural diversity研究。本研究建立黑色素瘤小鼠模型(所有动物实验均遵循中国药科大学动物伦理委员会的规定),通过腹腔注射VNP20009对其抗肿瘤活性进行验证,与对照组相比,VNP20009治疗可显著抑制肿瘤生长;体外共培养实验证明VNP20009能够诱导巨噬细胞向M1表型极化并表达相确认细节关炎症因子;通过流式细胞实验分析肿瘤和肿瘤引流淋巴结(tumor-draining lymph node,TDLN)内免疫变化,证明VNP2000NSC 119875作用9治疗诱导肿瘤组织免疫细胞增加,进一步分析发现肿瘤引流淋巴结内T细胞浸润增加,而VNP20009治疗能够诱导肿瘤内部的CD4~+T和CD8~+T细胞活化。本研究结果证明,VNP20009可通过诱导巨噬细胞向M1表型极化,招募并激活细胞毒性T细胞,协同其自身组分,共同抑制小鼠体内黑色素瘤的生长。

目的环境PM2.5对公众健康的影响已成为全世界关注的主要问题。许多研究表明,即使在非常低的水平下,PM2.5仍然对公众健康构成威胁。二次颗粒物是由一次颗粒物与空气和环境中的其他成分之间通过物理或化学反应产生的,二次颗粒物的特性会发生变化。1,4-萘醌吸附的黑炭(1,4 NQ-BC)是PM2.Navitoclax体内实验剂量5的重要组分,也是一种典型的二次颗粒物。巨噬细胞外捕网(METs)是巨噬细胞捕获和摧毁入侵病原体的手段,从而行使先天性免疫功能。程序性坏死是一种程序性细胞死亡方式,伴随着细胞膜完整性的破坏和细胞内容物的释放,从而诱发炎症反应。值得注意的是,IL33是一种重要的炎性因子。然而,目前还没有关于1,4 NQ-Bupper respiratory infectionC暴露后程序性坏死和METs之间的串扰机制的研究,也没有关于1,4 NQ-BC是如何调控IL33生成机制的研究。材料和方法在我们的研究中,我们选择RAW264.7细胞作为研究对象。采用了CCK8、AO/EB染色、SYTOX Green染色、荧光探针、qPCR、免疫荧光、蛋白免疫印迹和蛋白质组学等实验方法。结果及结论我们的实验发现,在正常生理条件下,当巨噬细胞接受外部刺激(如病原体等,在本实验中使用的是PMA)时,它们会形成METs,捕获并杀死病原体,从而行使先天性免疫功能。然而,暴露于1,4 NQ-BC可导致巨噬细胞发生程序性坏死,并伴随着ROS和胞浆钙离子水平的增加,以及炎症因子和趋化因子的表达紊乱,并阻止METs的形成,导致巨噬细胞失去部分捕获和杀死病原体的功能,从而削弱先天性免疫功能。值得注意的是,程序性坏死的抑制恢复了METs的形成,表明程selleckchem Imidazole ketone erastin序性坏死抑制了METs的形成。本研究首次探讨了程序性坏死和METs之间的串扰机制。此外,1,4 NQ-BC可以通过铁蛋白轻链(FTL)上调IL33的表达水平。

为Genetic reassortment了培育矮杆玉米品种，用栽培种材料DN132610和突变体材料DN132610-JQ11杂交获得6个世代群体，探究突变体株高遗传特性。以P_1、P_2、F_1、B_1、B_2、F_26个世代群体为试验材料，利用植物数量性状分离分析软件进行联合分析。结果表明，矮化突变体最适遗传模型为E-1，即2Pidnarulex对加性-显性-上位性主基因+加性-显性多基因混合遗传模型。2对主基因加性效应值均为-11.205，显性效应值分别是-28.303和-15.840,B_1、B_2和F_2主基因遗传率分别为57.26%、30.06%和76.85%，多基因遗传率分别为0%、28.06%和0%，环境因素引起的变异分别占42.74%,41.88%和23.15%。上述试验表明，控制玉米株高的2对基因以显性效应为主，主基因遗传率较高，B_1、F_2多基因遗传率为0%，且玉米株高受环境影响较大，存在遗传与环境互作效应，可结合环境鉴定，早期对株高性状进行选择。

背景与目的乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,以下简称HBV)是世界发展的难题,目前乙肝相关的肝病在未来几十年内仍然是全球影响的重要健康问题,乙型肝炎病毒感染仍然是一个难以满足的医疗需求。HBV是嗜肝DNA病毒科的一种小包膜DNA病毒,具有部分双链松弛环状DNA基因组。目前的HBV治疗方法,聚乙二醇化干扰素-α(PEG-IFNα)和长期核苷酸类似物(NUCs),可以将乙型肝炎病毒(HBV)复制减少到临床可检测水平以下,减少肝脏炎症,逆转纤维化,并部分恢复能够控制HBV的免疫反应,但很少能实现HBV治愈,其治愈的障碍主要包括共价闭合环状DNA(ccc DNA)难以清除,高病毒负荷(HBV DNA和HBs Ag)以及针对HBV的宿主先天性和适应性免疫应答受损。FUBP1又名远端上游结合蛋白1,编码具有644个氨基酸的蛋白质,是一种参与不同细胞过程的多功能DNA和RNA结合蛋白,FUBP1是转录、翻译和RNTLC bioautographyA剪接的主调节因子。前期本课题组发现PUF60可以抑制HBV前基因组RNA的降解与剪接进而调控乙肝病毒进程,我们通过文献研究查找发现PUF60往往与远上游元件(FUSE)和FUSE结合蛋白(FBP)形成复合物,发挥调控功能,并且研究发现FUBP1表达与肝癌细胞存在相关性,而HBV感染是晚期肝硬化和肝细胞癌的主要原因,因此我们推测FUBP1与HBV感染生命周期之间存在一定的联系,可能对HBV的转录调控发挥一定作用。材料与方法通过在Huh7细胞中转染pc DNA3.1-HA-FUBP1过表达质粒,应用蛋白印迹实验验证FUBP1过表达质粒构建成功,实现FUBP1过表达;同时或24h后转染p UC19-HBBj质粒,RT-q PCR实验验证FUBP1过表达对pg RNA、sp RNA、剪接效率的影响,并用northern blot进一步验证RT-q PCR的结果。文献研究发现PUF60、FUBP1两者形成复合体发挥调控功能,用RT-q PCR、海肾荧光素酶报告实验验证PUF60、FUBP1及两者的蛋白共表达对HBV pg RNA、前基因组启动子、ENII/BCP core启动子活性的影响;并且执行了Alpha screen实验、RNA降解实验验证FUBP1调控RNA转录进程是否与转录后RNA核外https://www.selleck.cn/products/azd9291.html输出和降解相关;构建一系列HBV启动子及突变体质粒,海肾荧光素酶报告实验检测过表达FUBP1对HBV启动子及其突变体活性的影响;并用凝胶迁移实验进一步验证FUBP1靶向HBV Enh II/core启动子区域。研究结果过表达FUBP1可降低pg RNA、sp RNA的表达水平并降低剪接效率,northern blot的结果进一步验证上述结果;FUBP1可通过下调HBV Enh II/BCP启动子的活性,抑制HBV转录;文献研究发现PUF60往往与FUBP1形成复合体发挥作用,我们的研究表明FUBP1是独立靶向HBV Enh/core启动子区域抑制HBV前基因组RNA的表达;进一步研究发现FUBP1抑制HBV pg RNA水平不是通过调控转录后HBV RNA核外输出及降解实现的;FUBP1是通过靶向启动子del-1,del-2区域共同序列(nt1640-Pidnarulex小鼠1652,具体碱基序列为:GCCCAAGGTCTTG)调控启动子活性,从而抑制HBV复制。结论1、FUBP1直接结合于HBV nt1640-1652区域下调启动子活性进而抑制乙肝病毒的转录;2、研究发现FUBP1在HBV转录进程中发挥负调控作用,是抗乙肝病毒治疗的潜在靶点。

铝(Al)毒显著限制了酸GSK126价格性土壤中植物的生长,缓解和修复酸性土壤中Al毒害问题已成为一个重要的研究领域。本研究根据水稻自身的解Al毒机制,通过基因工程技术成功构建携带水通道蛋白OsTIP2-1基因的酵母工程菌株,并将其用于含Al废水处理和提高酸性土壤中农作物抗Al性的实际应用中。同时也将定位于水稻根细胞膜且已被验证具有解Al毒作用的Os NIP1-2酵母工程菌与其同时添加,提高对含Al废水的处理效果,为获得解决环境中Al污染问题的有效方法奠定基础。首先分析了水稻OsTIP基因家族成员对Al毒胁迫的表达特性,结果表明OsTIP2-1显著受Al毒诱导表达;进而利用激光共聚焦显微技术确定了OsTIP2-1定位于液泡膜上;然后利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对野生型水稻中的OsTIP2-1基因进行编辑,获得了OsTIP2-1功能缺失突变体水稻,并以GDC-0068溶解度野生型水稻为对照,分析了突变体水稻在Al胁迫下的生长状况及其各部位的Al含量,结果表明,Al胁迫特异性且快速地诱导了OsTIP2-1在根中的表达,在两个独立的水稻品系中,OsTIP2-1的功能突变显著提高了水稻对Al的敏感性,但对其他金属的敏感性没有提高。与野生型水稻相比,ostip2-1突变体在根中的Al累积较少,在茎叶中的Al积累较多,表明OsTIP2-1参与了Al在水稻根部的过量累积,并限制了其向茎部的迁移。另外,与野生型水稻相比,ostip2-1突变体在细胞壁中的Al积累基本不变,而在细胞汁液的Al积累显著减少,说明OsTIP2-1在将Al转运和储存于根系液泡中的过程中发挥了重要功能。将OsTIP2-1+GFP的融合蛋白在酿酒酵母BY4741中异源表达,发现OsTIP2-1也定位于酵母菌液泡膜。铝毒耐受性实验结果表明,转入OsTIP2-1的酵母菌株比对照菌株对铝毒胁迫的耐受性更高,说明定位于液泡膜的OsTIP2-1通过促进酵母细胞质中Al隔离到液泡中来解Al毒,可作为后续工程菌株加以应用。将构建成功的OsTIP2-1工程菌株投加到Al污染废水中,结果表明,与野生型(转入空载体p YES2)酵母菌相比,过量表达OsTIP2-1基因的工程菌株对Al的去除率和吸收有所增加但不显著,而转化Os NIP1-2基因的工程菌株对Al的去除和吸收有显著增加,这可能与Os NIP1-2定位于细胞膜,而OsTIP2-1定位于液泡膜有关;但将两种工程菌同时投加时,其对Al的去除与吸收远远大于单独投加一种菌。究其原因,可能是由于Os NIP1-2定位于细胞质膜,能够直接接触Al污染水体中的Al,从而对其具有更直接的吸收或转化作用,Personal medical resources而OsTIP2-1定位于液泡膜,其无法直接吸收或转化环境中的Al,因此,其对Al的去除效果不太明显。此外,Os NIP1-2和OsTIP2-1显示出相似的细胞特异性定位,Os NIP1-2和OsTIP2-1同时添加时可能协同作用,即Os NIP1-2转运的Al被OsTIP2-1隔离到细胞液泡中。因此而同时投加两种工程菌株可以显著提高Al的去除率,从而解决了OsTIP2-1工程菌株对Al去除率低的问题。将OsTIP2-1工程菌株投加到水稻水培溶液中,在两个不同品种的野生型水稻(R1、R2)水培研究中,野生型菌株(转入空载体p YES2)、Os NIP1-2工程菌株和OsTIP2-1工程菌株的投加均使野生型水稻根生长得到了促进,但OsTIP2-1工程菌株效果更加显著,Os NIP1-2工程菌株次之。另外,投加工程菌株使得两种野生型水稻根部Al的含量减少。这说明Os NIP1-2、OsTIP2-1基因赋予了酵母菌株对抗Al毒的能力,从而使得这两种工程菌株促进Al环境下野生型水稻的生长。究其原因,可能是在酵母菌株中定位于细胞膜的Os NIP1-2和定位于液泡膜的OsTIP2-1具有在植物细胞中转运Al毒的协同作用,其分别将Al转运到酵母细胞质和液泡中,以减轻Al对水稻的毒害作用。