Author: admin

目的：获得九里香Murraya exotica L. Mant.全长转录组数据库，为深入挖掘其全长基因信息提供参考。方法：利用Pacino Sequel平台的第三代测序技术，对九里香的根、茎、叶、花、果混合样selleck激酶抑制剂品进行全长转录组测序，并对原始转录组数据进行分析。结果：共获得94 435个转录本，平均长度为76 476.23 bp,80 583条环形一致性序列，通过聚类、校正和去冗余后最终得到108 443个高质量的isoforms，其中在非冗余蛋白（NR）、核苷酸序列（NT）、基因本体（GO）、真核生物相邻类的聚簇（KOG）、蛋白家族（Pfam）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）和SwissProt共注释了100 219个isoforms，同时检测出34 182个简单序列重复（SSR）位点，其中18 482个单核苷酸数量占主导位置；检测了2574个转录因子，29 592个长链非编码RNAs (lncRNAs)和30 322个mRNAs。结论：获得了较为可靠的九里香全长转录组数据，为深入研究九里香的生长发育、相关代谢途径、功能基因利用、基原物种PS-341核磁鉴定等提Autoimmune blistering disease供数据参考。

背景:随着居民生活水平的提高及饮食结构的改变,结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)的发病率及死亡率逐年增加,其发病率已跃居肿瘤中第三位,死亡率位居第四位。CRC无特异的临床表现,内镜检查和病理诊断是金标准,其它辅助诊断依据包括腹部CT、腹部MRI及癌胚抗原等血清肿瘤标志物。腹部CT和MRI对CRC的诊断缺乏特异性,价格高,且存在射线辐射。血清肿瘤标记物适用于CRCFerrostatin-1临床试验的筛查,但其对CRC诊断的灵敏度和特异性一般。腹部CT和MRI对CRC肝脏转移及肺转移的诊断有一定优势,但对CRC腹膜转移诊断的灵敏度和特异性一般。因此,新的CRC特异性标志物及其检测方法在CRC及其腹膜转移的诊断方面拥有广阔的应用前景。Micro RNA-21与CRC关系密切。研究表明,CRC组织中micro RNA-21的含量明显高于癌旁组织,micro RNA-21促进CRC增殖与分化;表达micro RNA-21高的CRC与较晚分期、较差预后、化疗不敏感及较短的生存期密切相关。有研究报道micro RNA-21作为CRC诊断标志物的灵敏度和特异性均高于癌胚抗原。众多关于micro RNA-21与CRC的研究结果表明micro RNA-21与CRC密切相关,可作为CRC诊断及预后评估的标志物。腹膜转移是CRC的晚期表现,其诊断主要依靠手术探查和活检病理。由于腹部CT和MRI等方法对腹膜转移诊断的效果一般,很多腹膜转移直至开腹探查时才被发现,而此时手术及麻醉已给病人造成较大的创伤。因此,在较小创伤或无创伤的情况下诊断腹膜转移至关重要。腹膜转移的CRC病人往往拥有严重消瘦和体重骤减的特点,即腹膜转移病人存在严重的能量代谢紊乱。ATP是能量代谢的产物和标志物,且与CRC关系密切。ATP分为细胞内ATP和细胞外ATP(Extracellular ATP,e ATP)。e ATP是指细胞外的ATP,比如组织间隙和血浆中的ATP。有文献报道,正常组织间隙不含ATP或含有极少量的ATP,而肿瘤原发部位或者转移部位e ATP含量很高,是正常组织间隙中ATP的千倍甚至万倍。高浓度的e ATP与CRC细胞表面的腺苷能受体P2RX7结合,激活信号通路,促进CRC增殖、浸润、转移和耐药的发生。本研究通过构建新的micro RNA-21和ATP检测方法并利用该方法检测病人血液或者体液中micro RNA-21和ATP,从而实现对CRC及其腹膜转移的诊断。国内外学者开发多种检测micro RNA和ATP的方法,但这些方法多存在检测过程复杂、耗时、成本较高、检测限(Limit of detection,LOD)一般及对设备要求高等不足。本研究利用碱基互补配对原则构建基于双发夹连接介导等温扩增反应(Dual hairpin ligation-induced isothermal amplification,DHLA)的micro RNA-21和ATP检测方法。这两种方法具有灵敏度高、特异性好、设计简单、容易操作及设备要求低等优点。使用构建的方法检测细胞系及实际病人血浆中的micro RNA-21和ATP发现CRC细胞系micro RNA-21表达量高于正常结肠粘膜细胞系,CRC病人血浆中micro RNA-21的含量高于健康对照者;CRC细胞主动获取培养液中ATP,而正常结肠粘膜细胞分泌ATP至培养液;腹膜转移CRC病人血浆中的ATP含量明显高于早期CRC病人血浆中ATP。上述结果为CRC的诊断及CRC腹膜转移的诊断开辟新的方向。方法:1.构建基于DHLA的micro RNA-21检测,具体方法如下:(1)利用碱基互补配对原则设计检测所用的模板链和引物,使用Nupack在线软件验证。(2)模板链的浓度、模板链之间的浓度比、指数扩增反应温度、连接酶用量及引物链浓度的优化:优化的模板链浓度为60 n M、30 n M、15 n M和3 n M;优化的模板链A和模板链B的浓度比例为2:1、1:1及1:2;优化的引物混合物浓度为1.6μM、1.2μM、0.8μM和0.4μM;优化的指数扩增反应的温度为58℃、60℃、62℃、63℃;优化的Bst 2.0 DNA聚合酶的量为1.5μL和2.0μL。(3)Micro RNA-21检测的LOD及荧光曲线最大斜率时间(Point of inflection,POI)与micro RNA-21浓度线性关系:逐级稀释不同浓度的micro RNA-21为实验组,超纯水为阴性对照,按照优化后的条件实验,获得LOD及micro RNA-21浓度与POI值之间的线性关系。(4)Micro RNA-21检测的特异性分析:选择生物体内常见的micro RNA(如micro RNA-141、let-7d和micro RNA-200b)及超纯水作为对照,按照优化后的条件实验。2.构建基于DHLA的ATP检测,具体方法如下:(1)模板链之间的浓度比、连接时间及连接酶用量的优化:模板链P1和P2的浓度为60 n M,选择优化的模板链P3的浓度为30 n M、60 n M、120 n M和180n M;选择优化的T4 DNA连接酶浓度为0.016 U/μL、0.16 U/μL、1.6 U/μL及16U/μL;选择优化的连接时间为30 min、60 min、90 min和120 min(2)ATP检测的LOD及Cq值与ATP浓度线性关系:逐级稀释不同浓度的ATP为实验组,不含ATP的超纯水为阴性对照,按照优化后的条件实验,获得LOD及ATP浓度与Cq值之间的线性关系。(3)ATP检测的特异性分析:以ATP的类似物(GTP、UTP、CTP和腺苷)及超纯水作为阴性对照,按照优化后的条件实验。3.结肠癌及正常结肠粘膜细胞系中micro RNA-21和ATP:(1)体外培养结肠癌细胞SW 620和DLD-1及正常结肠粘膜细胞FHC。(2)使用柱式micro RNA提取试剂盒提取SW 620、DLD-1及FHC细胞中micro RNA;超声波裂解方法获取细胞中ATP,离心获取待测培养液。(3)使用构建的micro RNA-21及ATP检测方法检测细胞系中mciro RNA-21及细胞系和培养液中ATP。4.CRC病人血浆中micro RNA-21和ATP:(1)使用抗凝血管抽取晨起、空腹状态的10例CRC病人及5例健康志愿者血液;使用柱式micro RNA提取试剂盒提取血浆中的micro RNA。(2)使用抗凝血管抽取晨起、空腹状态的10例早期CRC病人及5例腹膜转移CRC病人血液;通过静置及多次离心获取待测血浆。(3)使用构建的micro RNA-21及ATP检测方法检测血浆中mciro RNA-21及ATP。结果:1.基于DHLA的micro RNA-21检测的LOD在~a M水平,特异性好,可区分不同种类的micro RNA。2.基于DHLA的micro RNA-21检测拥有较小的基质效应,可检测结肠细胞及CRC病人血浆中的micro RNA-21。3.基于DHLA的ATP检测的LOD在~f M水平,特异性好,可区分ATP与其类似物。4.基于DHLA的ATP检测拥有较小的基质效应,可检测结肠细胞系及CRC病人血浆中Abiotic resistance的ATP。5.CRC细胞系micro RNA-21表达量高于正常结肠粘BAY 73-4506体内膜细胞系,对比SW 620细胞,DLD-1细胞低表达micro RNA-21。6.CRC病人血浆中的micro RNA-21含量较健康志愿者血浆高。7.CRC细胞获取培养液中ATP,正常结肠粘膜细胞分泌ATP至培养液。8.腹膜转移CRC病人血浆中的ATP浓度明显高于早期CRC血浆中ATP浓度。结论:1.基于DHLA的micro RNA-21和ATP检测,拥有超高的灵敏度和较好的特异性,拥有较小的基质效应,可检测生物样本中的micro RNA-21和ATP。2.对比SW 620,DLD-1低表达micro RNA-21,CRC病人血浆中micro RNA-21含量较健康志愿者高,为CRC诊断提供新的标志物及检测方法。3.CRC细胞获取培养液中ATP,正常结肠粘膜细胞分泌ATP至培养液;腹膜转移CRC病人血浆中ATP较早期CRC病人血浆中ATP含量高,为CRC腹膜转移的诊断提供新的方法及研究方向。4.构建的基于DHLA的micro RNA-21和ATP检测,为试剂盒的开发提供依据,为CRC的社区筛查及CRC病人居家自测提供新的思路。

目的:沉默信息调节蛋白3(Sirtuin3,SIRT3)是存在于线粒体中的去乙酰化酶,它通过对线粒体内蛋白质的去乙酰化调控线粒体的主要生物学功能,进而影响细胞周期、细胞能量代谢、细胞氧自由基的清除等大量细胞生物过程。大量研究表明SIRT3的缺失会导致一系列诸如高血压、动脉粥样硬化、主动脉夹层等血管疾病。但是SIRT3对腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)的影响却未见相关报道,本研究旨在明确SIRT3对AAA发生或发展的相关影响,并探究SIRT3在AAA形成过程中通过何种机制发挥作用。方法:1.人类AAA临床样本的收集收集临床腹主动脉瘤手术E7080配制患者切下的AAA组织,并选择离瘤体尽可能远且其形态相对正常的腹主动脉节段组织作为对照组;通过western blot检测SIRT3的蛋白表达水平,并使用Image J软件进行灰度值分析。并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phoHepatocyte histomorphologysphate dehydrogenase,GAPDH)为参照对SIRT3在不同组织间表达水平进行半定量分析。2.SIRT3~(+/+)与SIRT3~(-/-)小鼠的基因鉴定和繁殖为研究SIRT3在AAA形成中的相关作用及机制,我们委托专业的生物科技公司构建了SIRT3基因敲除小鼠。繁殖小鼠F1代基因型分别为:♂SIRT3~(+/-)×♀SIRT3~(+/-)按公母比1:2进行配种。获得F2代小鼠后,通过基因鉴定,筛选出SIRT3~(+/+)和SIRT3~(-/-)小鼠继续用于繁殖。F2代小鼠繁殖策略为:通过♂SIRT3~(+/+)×♀SIRT3~(+/+)繁殖出F3代SIRT3~(+/+)小鼠用于实验,通过♂SIRT3~(-/-)×♀SIRT3~(-/-)繁殖出F3代SIRT3~(-/-)小鼠用于实验。3.C57BL/6N小鼠AAA模型的诱导和组织处理按照随机原则在同一批购买的小鼠中选取10-14周的雄性C57BL/6N小鼠进行实验,开腹后在电子视频显微镜下测量小鼠肾动脉下腹主动脉最大直径,记为小鼠腹主动脉术前直径。随后使用猪胰腺弹性蛋白酶(Elastase from porcine pancreas,PPE)对小鼠腹主动脉进行外敷5分钟。并以同样方法用生理盐水(saline)外敷于小鼠腹主动脉5分钟建立对照组。在小鼠术后第13天使用异氟烷麻醉小鼠后通过小动物彩超机对小鼠肾动脉下腹主动脉最大直径进行测量。在小鼠术后第14天再次麻醉小鼠,将小鼠腹部打开并使用视频显微镜对腹主动脉直径进行测量,记录为术后直径。测量结束后立即取材,通过western blot分析SIRT3、平滑肌蛋白22α(smooth muscle 22 alpha,SM22α)、线粒体融合蛋白2(mitofusin2,MFN2)等相关蛋白在小鼠AAA组织以及相应的对照组小鼠腹主动脉组织中的表达情况。为进一步证明相关问题,我们通过免疫组织化学染色对比了小鼠ALGX818分子式AA组织和生理盐水处理的假手术组小鼠腹主动脉组织间SIRT3的表达情况。最后我们通过苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)、弹力纤维染色(Verhoeff’s Van Gieson,EVG)等血管常用病理染色方法去观测两组小鼠腹主动脉发生的病理学改变。并根据血管弹力纤维降解、断裂情况,对小鼠腹主动脉损伤情况进行评分并行统计学分析。4.SIRT3基因编辑小鼠AAA模型的构建和组织处理按照上述步骤繁育出符合实验要求的SIRT3~(-/-)和同批次SIRT3~(+/+)公鼠,待其10～14周时将小鼠分为四组。分别是:基因型为SIRT3~(-/-)且使用生理盐水处理的SIRT3 KO sham组、基因型为SIRT3~(-/-)且使用PPE处理的SIRT3 KO PPE组、基因型为SIRT3~(+/+)且使用生理盐水假手术(sham)处理的SIRT3 WT sham组、以及基因型为SIRT3~(+/+)且使用PPE处理的SIRT3 WT PPE组。分别对上述分组的小鼠进行PPE或者sham手术处理后小鼠正常饮水饮食。在小鼠术后第13天使用异氟烷麻醉小鼠后通过小动物彩超机对小鼠腹主动脉直径进行测量。在小鼠术后第14天在戊巴比妥钠麻醉下使用视频显微镜对小鼠肾下腹主动脉最大直径进行测量记录为术后直径,随后进行腹主动脉组织取材。通过western blot分析小鼠AAA组和对照组间SIRT3、MFN2、SM22α、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptors-γ,PPARγ)、腺苷酸活化蛋白激酶(Amp-activated protein kinase,AMPK)等关键蛋白的表达情况。最后通过HE、EVG等染色技术观测小鼠腹主动脉病理改变及弹力纤维损伤情况,并对小鼠弹力纤维降解情况进行评分和分析。5.统计方法数据以SPSS 26.0为统计学分析软件,以均数±标准误(mean±SE)表示,符合正态分布的两组间数据比较用独立样本T检验,多组数据组间多重比较采用单因素方差分析加Bonferroni事后检验。本研究所有统计学分析中,P<0.05代表具有统计学意义。采用Graph Pad prism 8.0进行作图。结果:1、SIRT3在人AAA组织中表达下调。2、相较于生理盐水处理的对照组C57BL/6N小鼠,PPE诱导的模型组C57BL/6N小鼠的腹主动脉组织中SIRT3表达明显下降。3、相较于生理盐水处理的对照组C57BL/6N小鼠,PPE诱导的模型组C57BL/6N小鼠的腹主动脉组织中SM22α和MFN2表达下降,提示经PPE诱导后血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖增加,细胞表型发生转换。4、SIRT3缺失促进AAA的形成。5、SIRT3缺失后SM22和MFN2表达下调,VSMCs增殖和表型转换加剧。6、单纯SIRT3敲除不能促进VSMCs表型转换且对AMPK、PPARγ的表达无影响。7、SIRT3通过调控AMPK、PPARγ的表达,抑制VSMCs表型转换,抑制PPE诱导的AAA的发生和发展。结论:SIRT3缺失后可能通过调控AMPK/PPARγ信号通路促进VSMCs表型转换,从而促进AAA的发生和发展,SIRT3可能是治疗AAA的潜在靶点,上调SIRT3的表达或有助于预防AAA的形成。

背景：聚偏氟乙烯具有压电性能、良好的生物相容性和无毒性，使其成为骨膜修复合适的候选材料。目的：评价掺锌镁离子静电纺丝聚偏氟乙烯压电仿生骨膜的体外细胞毒性。方法：采用静电纺丝技术分别制备纯聚偏氟乙烯、掺锌离子聚偏氟乙Phage time-resolved fluoroimmunoassay烯、掺镁离子聚偏氟乙烯、掺锌镁离子聚偏氟乙烯压电仿生骨膜，依次命名为PVDF、PVDF-Zn、PVDF-Mg和PVDF-Zn-Mg，其中锌、镁离子的质量分数均为1%。将成骨细胞、血管内皮细胞分别与4组仿生骨膜共培养，通过碱性磷酸酶染色、CD31免疫荧光染色、扫描电镜观察与CCK-8法检测仿生骨膜的细胞相容性。结果与结论：(1)成骨细胞：培养7 d的碱性磷酸酶染色显示，PVDF-Zn组碱性磷酸酶分泌多于其他3组。扫描电镜下可见，培养1 d时，细胞在PVDF-Mg和PVDF-Zn-Mg仿生骨膜表面得到了一定的铺展，伪足向四周伸展；到3 d时，各组细胞边缘向材料伸出伪足；到确认细节第5,7天时，细胞铺展充分、生长形态良好且牢牢地覆盖在纤维表面，细胞伪足向四周及纤维空隙中伸展。CCK-8检测显示，随着时间的推移，各组仿生骨膜上的细胞增殖呈上升趋势，培养1,3,5,7 d的细胞相对增殖率均≥75%，细胞毒性≤1级。(2)血管内皮细胞：培养3 d的CD31免疫荧光染色显示，细胞在各组仿生骨膜上良好地黏附和铺展，彼此连接，其中PVDF-Zn-Mg组细胞数量多于其他3组。扫描电镜下可见，培养1,3 d时，细胞开始黏附在各组纤维表面；到5 dProtein Tyrosine Kinase抑制剂时，细胞在纤维表面均铺展良好并伸出明显的伪足；到7 d时，PVDF-Mg、PVDF-Zn-Mg仿生骨膜上的细胞呈复层生长，并伸展伪足至纤维空隙内。CCK-8检测显示，随着时间推移，各组仿生骨膜上的细胞增殖呈下降趋势，培养1,3,5,7 d的细胞相对增殖率均≥125%，细胞毒性为0级。(3)结果表明：掺锌镁离子静电纺丝聚偏氟乙烯压电仿生骨膜具有良好的细胞相容性。

中国是世界上最大的马铃薯生产国之一,2018年马铃薯生产面积超过481万公顷,生产马铃薯达18064万吨,分别占世界马铃薯种植面积和马铃薯产量的27.36%和24.53%。随着马铃薯产业的蓬勃发展,困扰马铃薯产业intensity bioassay的问题也越来越多,其中球炭疽菌做为危害马铃薯的病原之一,不仅使得马铃薯减产,而且严重影响马铃薯的商品性。为研究球炭疽菌引起的马铃薯炭疽病的生物防治,筛选优良拮抗菌株,并研究其抑菌机制非常必要。本试验研究对象为分离自东祁连山高寒草地牧草珠芽蓼中的枯草芽孢杆菌ZA1S,前期研究结果表明其对球炭疽菌(Colletotrichum coccodes)的拮抗能力突出,其乙酸乙酯萃取液表现出较强抗菌活性。本试验通过柱层析法和多种光谱信息确定代谢物的结构,结合转录组学和代谢组学挖掘菌株ZA1S在抗病过程中的功能基因,取得以下成果:1.枯草芽孢杆菌ZA1S抑菌活性研究内生菌株ZA1S对11株病原真菌均具有拮抗作用,其中对球炭疽菌和辣椒炭疽菌(C.tabaci)的抑制率分别达81.93%和78.82%;乙酸乙酯提取液对球炭疽菌的抑制率为31.48%,使球炭疽菌的产孢量从1.1×10~6个/m L下降至5.8×10~5个/m L,对辣椒炭疽菌的孢子萌发抑制率高达83.67%。该结果表明ZA1S可从菌丝生长、产孢和孢子萌发3个方面起到抗菌作用,具有开发为优良生物控制剂的潜力。根据菌株ZA1S的形态特征和分子聚类分析将其鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。2.枯草芽孢杆菌ZA1S代谢物的分离及鉴定从内生菌株ZA1S代谢物中共分离得到6个化合物,经多重光谱方法分析,分别鉴定selleck NMR为环(亮氨酸-酪氨酸)二肽(Bs1)、环(酪氨酸-苯丙氨酸)二肽(Bs2)、胸腺嘧啶(Bs3)、染料木苷(Bs4)、黄豆苷源(Bs5)和金雀异黄酮(Bs6),其中,Bs1至Bs6对球炭疽菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为0.8 mg·m L~(-1)、0.8 mg·m L~(-1)、2 mg·m L~(-1)、1 mg·m L~(-1)、1 mg·m L~(-1)和0.5 mg·m L~(-1),抗菌活性差异显著,与福美双的MIC值为1.25 mg·m L~(-1)相比,除胸腺嘧啶外,其余化合物抑菌能力均较强,进一步证实菌株ZA1S开发为生防制剂的可靠性。3.枯草芽孢杆菌ZA1S代谢物体外抗氧化活性研究6种代谢物均具有清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的能力,其中染料木苷清除效果最明显,清除率为67.19%;除胸腺嘧啶外,其他代谢物清除2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基的能力更强,清除率均达到99%以上,且与代谢物浓度呈正相关;6个化合物对·OH的清除能力比较一致,清除率介于63%-72%之间,呈现出计量依赖的特征。染料木苷浓度为1 mg·m L~(-1)时,对O_2~-·的清除率最高,为67.84%,其他5个代谢物对O_2~-·的清除效果不明显。该结果表明菌株ZA1S代谢物在体外具有较好的抗氧化活性,为菌株ZA1S附加产品的开发和应用提供理论依据。4.枯草芽孢杆菌ZA1S代谢物抑制球炭疽菌的作用方式6种代谢物处理球炭疽菌后,菌丝分别表现出扭曲、内含物增加、停止生长、菌丝膨胀和分枝增加的症状;当染料木苷、黄豆苷源和金雀异黄酮使用剂量分别为0.5 mg·m L~(-1)、0.25 mg·m L~(-1)和0.5 mg·m L~(-1)时对菌丝细胞膜造成的破坏最大,检测到丙二醛(MDA)浓度分别为0.98 mmol·L~(-1)、0.73 mmol·L~(-1)和0.86 mmol·L~(-1),另外3种代谢物处理后MDA值最大为0.33 mg·m L~(-1),表明病原菌菌丝细胞膜受损程度较小;当胸腺嘧啶、染料木苷、黄豆苷源和金雀异黄酮的浓度分别为0.25mg·m L~(-1)、0.125 mg·m L~(-1)、0.125 mg·m L~(-1)和0.0625 mg·m L~(-1)时麦角甾醇合成受阻,随着浓度的升高麦角甾醇无法参与细胞膜的合成;环(亮氨酸-酪氨酸)二肽、环(酪氨酸-苯丙氨酸)二肽、染料木苷、黄豆苷源和金雀异黄酮浓度分别为0.1mg·m L~(-1)、0.1 mg·m L~(-1)、0.125 mg·m L~(-1)、0.125 mg·m L~(-1)和0.0625 selleck产品mg·m L~(-1)时,蛋白含量最低,分别为298μg·m L~(-1)、301μg·m L~(-1)、334μg·m L~(-1)、328μg·m L~(-1)和337μg·m L~(-1);当染料木苷、黄豆苷源和金雀异黄酮的浓度分别为1 mg·m L~(-1)、1 mg·m L~(-1)和0.5 mg·m L~(-1)时,菌丝体的胞外纤维素酶(Cx)活性分别下降3倍、1.2倍和1.4倍。该结果表明,菌株ZA1S产生的代谢物抗真菌作用可能是通过破坏菌丝结构,导致菌丝体细胞渗漏等造成。5.联合转录组学和代谢组学揭示枯草芽孢杆菌ZA1S抑制球炭疽菌的关键基因为明确枯草芽孢杆菌ZA1S防治球炭疽菌过程中发挥调控作用的基因,所以对菌株ZA1S进行转录组和代谢组分析。利用转录组测序筛选到4168个差异表达基因,其中1026个基因上调表达,2130个基因下调表达;1911个差异基因富集到生物反应、细胞组分和分子功能中,富集基因数分别为768(上调141,下调111)、235(上调119,下调116)和874(上调210,下调202),主要在氧化-还原过程、发育过程、膜的作用和氧化还原酶活性等生物过程中发挥作用;差异基因显著富集在7个KEGG信号通路中,最主要的是辅助因子的生物合成和嘌呤代谢,具有调控作用的差异基因188个,其中上调95,下调93。通过代谢组学筛选到529个差异代谢物,35个代谢物上调,28个代谢物下调;上调代谢物包括D-甘露醇、半乳糖醇、9,12,13-三羟基-10,15-十八碳二烯酸、顺式乌头酸和腺苷-5′-单磷酸等,下调代谢物有3-吲哚丙烯酸、L-焦谷氨酸、L-哌啶酸、N6-(2-羟乙基)腺苷等;富集在88个KEGG通路中,代表性通路包括赖氨酸降解、核苷酸代谢、柠檬酸循环(TCA循环)、乙醛酸和二羧酸的代谢和磷酸转氨酶系统(PTS)等相关通路。分析表明,差异基因和差异代谢物共同富集的前25个KEGG通路中,其中5个代谢物和18个基因注释在乙氧基化物和二羧酸盐通路中,8个代谢物和86个基因注释在辅助因子的生物合成通路中,6个代谢物和11个基因注释在赖氨酸的降解通路中。筛选出3个典型的差异代谢物顺式乌头酸、腺苷-5′-单磷酸和L-哌啶酸,分别被亚氯酸盐歧化酶家族、硫醇酶,N端结构域|硫醇酶,C端结构域、醛脱氢酶家族、吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶|吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶,二聚结构域和吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶,二聚结构域|吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族中的基因调控。抑制球炭疽菌生长过程中高含量的顺式乌头酸和腺苷-5′-单磷酸以及低含量的L-哌啶酸有助于拮抗作用的产生。调控3个差异代谢物的基因hem Q、ald Y、ald X、lpd A1、lpd A2、aco L和yhf S的表达量均高于对照,说明这些基因在抑制球炭疽菌的过程中发挥重要作用。

甘蓝型油菜(Brassica napus)是全球重要油料作物之一。长江流域是我国油菜的主产区,目前晚稻茬口矛盾问题突出,亟须选育早熟高产品种应用于迟播油菜生产。同时,一直以来在油菜中适时开花和理想分枝是两个重要遗传改良目标。SPL (SQUAMOSA promoter-binding protein-like)是一类植物特有的转录因子,已有研究表明SPL基因家族成员参与植物生长发育的各个阶段,如调节植株形态建成、营养生长向生殖生长的转变、次生代谢、激素信号传递、光信号感知和非生物胁迫响应。同时,在拟南芥和水稻中已报道了部分SPL转录因子影响分枝和产量,而在油菜中有关其研究较少。本研究中,我们以甘蓝型油菜SPL基因家族全部成员作为CRISPR/Cas9系统的靶基因,利用多载体混合文库转化体系结合高通量测序技术,建立了一套甘蓝型油菜突变体创制和筛选方法和技术流程。结果显示,通过CRISPR混合文库高通量测序技术共获得258株甘蓝型油菜转基因阳性植株,其单载体插入的编辑效率为50.31%,多载体插入的编辑效率为36.63%(n=2-7),并鉴定到早花和多分枝数的甘蓝型油菜突变体。在SPL突变体库中分离了BnaA06.SPL4的单突变体和BnaA06.SPL14,BnaC05.SPL14的双突变体并进行田间表型考察。研究发现,较野生型品种bnaspl4~(CR)和bnaspl14~(CR)突变体的开花期提前4-6天,而bnaspl14~(CR)突变体的一次有效分枝数增Alisertib溶解度加7-9个。结果表明BnaSPL4和BnaSPL14可能参与开花调控,BnaSPL14可能参与分枝调控。另一方面,bnaspl4~(CR)spl14~(CR)三突变体较野生型品种表现出开花期提前5-7天,一次分枝增加7-10个,并且产量显著提高50.8%-60.9%。RNAseq分析结果发现,差异表达基因GO富集结果表明,在bnaspl4~(CR)和bnaspl4~(CR)spl14~(CR)突变体中,昼夜节律、开此网站花及光周期相关途径基因被显著富集,而与芽的形成和发育Microbiota-independent effects相关的差异基因在bnaspl14~(CR)和bnaspl4~(CR)spl14~(CR)突变体中被显著富集。采用q RT-PCR和Dual-Luc实验验证,结果表明BnaSPL4能够抑制SOC1 (SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1)和PRR7 (PSEUDO-RESPONSE REGULATOR 7)的表达,而BnaSPL14能够抑制MAX1 (MORE AXILLARY GROWTH1)的表达。因此,BnaSPL4是调节开花和昼夜节律的转录抑制因子,而BnaSPL14是调节分枝相关基因的转录抑制因子。综上所述,本研究为油菜的功能基因组研究和遗传改良提供了宝贵的种质资源和策略。

囊泡运输是真核生物细胞内物质运输的一种常见机制,Ric1-Rgp1复合体在其中发挥重要作用。然而,在禾谷镰孢菌中该蛋白复合体的生物学功能尚未研究。因此,本研究通过生物信息学分析,在禾谷镰孢菌中鉴定出Rgp1和Ric1蛋白并命名为FgRgp1与FgRic1;通过同源重组的方法分别获得两个基因的缺失突变体;通过对野生型、突变体和回补转化子的生长发育、内吞作用观察、DON含量分析和致病力等实验测定禾谷镰孢菌ΔFgRgp1和ΔFgRic1的natural biointerface功能。结果表明,与野生型和回补转化子相比ΔFgRgp1和ΔFgRic1菌丝生长速度显著减慢,产孢周期延长此网站,产孢量显著减少,胞吞作用延缓,液泡融合受阻,DON毒素产量下降和致病力显著MK-4827采购减弱。综上所述,FgRgp1与FgRic1可能作为关键组分调控禾谷镰孢菌的囊泡运输和胞吞作用,进而影响其生长发育、致病力和DON毒素的产生。

二苯乙烯和二苯乙烯氧糖苷单体及其低聚物是存在于多种植物中的天然多酚类化合物,是自然界的瑰宝之一。过去60年来,人们对以白藜芦醇为代表的二苯乙烯及其单体衍生物已做了深入研究,发现它们具有如抗氧化、抗癌、抗衰老等丰富的药理活性。在二苯乙烯的酚羟基上引入糖苷形成的二苯乙烯氧糖苷单体,可以大大增强其水溶性和稳定性。近年来,二苯乙烯及其氧糖苷单体的低聚物因其复杂的结构和多样的生物活性而引起生物学家及化学家们的广泛兴趣,Standardized infection rate已有研究表明二苯乙烯低聚物比其单体表现出更高的药理活性。虽然二苯乙烯氧糖苷单体和二苯乙烯低聚物在自然界中分布广泛,但由于其天然含量低,极性大且骨架结构复杂多样,存在提取成本高、分离提纯困难和产率低等问题,从而限制了对其在药物及其他领域应用潜力的进一步开发,因此急需通过人工合成方法对这类化合物开展深入研究。但目前有关二苯乙烯低聚体及其氧糖苷的合成研究,依然面临路线长、选择性差、产率低等诸多挑战。本课题组近20年来一直致力于二苯乙烯二聚体的区域选择性仿生合成研究并取得了一些成果,在此基础上,本论文拟对买麻芦醇和氧化白藜芦醇的氧化二聚反应开展研究,同时合成买麻芦醇氧糖苷和氧化白藜芦醇氧糖苷单体,为探索二苯Erdafitinib纯度乙烯氧糖苷低聚物的仿生合成奠定基础。本论文主要从以下三个章节进行分析和讨论:第一章主要概述了异戊烯基和糖基对二苯乙烯的结构修饰,总结了近年来多种天然异戊烯基二苯乙烯类似物和糖苷化二苯乙烯衍生物的合成方法,分析了异戊烯和糖基作为关键基团对二苯乙烯进行结构修饰后表现出与其他官能团之间的相互作用和药理活性。第二章合成天然买麻芦醇单体并开展了其氧化二聚反应的研究。首先以3,5-二羟基苯甲酸甲酯为起始原料经四步反应制备中间体磷盐;从2,6-二羟基苯甲酸出发经四步反应制备多取代的苯甲醛;然后中间体磷盐和苯甲醛经Wittig反应和脱苄基保护反应合成了买麻芦醇单体。接下来研究了买麻芦醇单体在不同催化剂条件下的氧化二聚反应,发现买麻芦醇单体在辣根过氧化酶(HRP)-H_2O_2、三氯化铁、铁氰化钾和氧化银氧化下没有新产物生成,而在氧化银-碳酸钾条件下得到了唯一产物3,3′,5,5′-四羟基二苯乙烯2-21,在甲酸回流条件下得到了极性相同的芳基萘化合物2-22和二苯乙烯2-21的混合物。苄基保护的氧化白藜芦醇在用三氯化铝和N,N-二甲基苯胺条件下脱苄基保护时,得到极性相同的氧化白藜芦醇与化合物2-21的混合物,该混合物在氧化银-碳酸钾或甲酸回流条件下生成了二苯乙烯2-21。这表明化合物2-21的形成与买麻芦醇和氧化白藜芦醇的2位羟基有直接关系,对其转化机理仅做了初步推测,还有待进一步探索和验证。第三章通过化学方法首次合成了买麻芦醇-2′-氧糖苷单体,在此合成策略及条件优化的基础上合成了氧化白藜芦醇-2′-氧糖苷单体。首先尝试了对买麻芦醇直接进行糖苷化反应,但并未成功;接着对合成的3,5-二甲氧基买麻芦醇进行糖苷化反应依然没有得到糖苷化产物。最后采用先糖苷化后构建二苯乙烯双键的策略,先通过中间体苯甲醛与乙酰溴-α-D-葡萄糖的糖苷化反应制得2-氧糖苷苯甲醛化合物,再经Wittig反应和脱苄基保护顺利合成买麻芦醇-2′-氧糖苷单体。采用类似的合成策略,从2,4-二羟基苯甲醛出发,经过选择性保护、糖苷化、Wittig反应和脱保护成功制备了氧化白寻找更多藜芦醇-2′-氧糖苷单体。综上所述,买麻芦醇在不同氧化催化条件下的氧化二聚反应并没有得到预期的自身二聚物,而是意外得到对称的二苯乙烯2-21或其与芳基萘化合物2-22的混合物。氧化白藜芦醇在相似反应条件下的氧化二聚也生成了二苯乙烯单体2-21。化合物2-21的生成机理还需进一步进行探索和验证。在合成买麻芦醇氧糖苷和氧化白藜芦醇氧糖苷过程中,都采取了选择性糖苷化-Wittig反应-脱苄基保护的基本策略,通过优化糖苷化反应,尝试了不同的脱保护条件,最终成功得到了目标产物买麻芦醇氧糖苷和氧化白藜芦醇氧糖苷单体。这为糖苷化二苯乙烯类似物的合成提供了一种有效的策略并对其二聚物的仿生研究奠定了基础。

芦笋是一种雌雄异株多年生的经济作物,嫩茎供食用,质嫩味美,营养丰富,被誉为“蔬菜之王”。它的株型、雌雄性别与其产量和品质有密切关系,研究芦笋株型控制和性别决定的遗传基础与分子机制,对芦笋高产优质育种具有重要意义。2017年国际合作团队完成了芦笋基因组测序组装,预测共有27,656个编码基因,然而绝大多数基因的功能并不清楚。近几年兴起的CRISPR/Cas9基因编辑技术已成为农作物基因功能研究与分子育种的重要工具,但在芦笋中的应用尚未见报道。本研究通过遗传作图对芦笋株高、茎数CH-223191作用、茎粗等株型性状进行QTL定位与候选基因筛选;构建芦笋CRISPR/Cas9高效基因编辑技术,获得芦笋株型相关性状候选基因的功能缺失突变体,开展基因生物学功能分析;同时靶向编辑芦笋性别决定基因SOFF和asp TDF1,获得芦笋性别突变体。主要研究结果如下:(1)获得了2年4个生长季节芦笋栽培品种台南选3号雌株(TN3)和近缘野生种兴安天门冬雄株(XA)及二者种间F_1杂种雌雄2个单株、100株F_2分离个体的株高、茎数、茎粗等表型数据,分析表明这三个性状都呈数量性状的遗传方式,且三者之间特别International Medicine是株高与茎粗之间极显著正相关,相关系数最高达到0.793(P<0.01)。利用dd RAD-seq开发的SNP以及相关功能基因的STS和CAPS标记,构建了一张含有10个连锁群的芦笋高密度遗传图谱,共包含1,218个分子标记,总图距为4,277.34 c M,平均图距为3.51 c M。基于ICIM-ADD方法对芦笋株高、茎粗、茎数等性状进行QTL分析,在2年4个生长季节中共检测出了株型相关性状QTL 17个,LOD值在3.67～10.93之间,可解释6.83～32.87%表型贡献率,其中有4个不同生长季节的株高QTL和3个不同生长季节的茎粗QTL均位于第5号染色体40,131,970～46,821,499间约6.52 Mb区域。该区域有102个预测基因,其selleck PD0325901中Ao SPL14a编码squamosa promoter-binding-like protein 14蛋白,它与水稻理想株型IPA1(Os SPL14)基因高度同源,且在株型显著差异的双亲之间1、3号外显子中存在5个错义SNP,XA表现为矮生细茎性状可能与之有关。Ao SPL14a基因在芦笋嫩茎和拟叶中的相对表达量较高,矮生细茎亲本XA嫩茎中表达量显著下降。结果表明,Ao SPL14a很可能是调控芦笋株高和茎粗的关键基因。(2)基于拟南芥U6基因的保守性,克隆了芦笋2个U6启动子Asp U6P3和Asp U6P6用于驱动sg RNA表达,以此分别构建了携带潮霉素或卡那霉素抗性基因的sg RNA和Cas9共表达载体,一共4套。并以芦笋株高和茎粗候选基因Ao SPL14a为靶基因构建了4个具有卡那霉素抗性的CRISPR/Cas9表达载体,分别通过农杆菌介导遗传转化芦笋品系‘JXT4’胚性愈伤组织。抗性愈伤组织测序分析结果显示,装载Asp U6P3启动子的两个载体3KI1和3KI2愈伤基因编辑率分别为70.00%、78.13%,结果表明芦笋内源U6启动子Asp U6P3具有高效转录活性,可驱动下游sg RNA的表达。抗性愈伤组织诱导分化和再生成苗,转载体3KI1和3KI2的再生植株转基因阳性率分别为46.67%和44.00%,再生植株基因编辑效率分别为64.29%和81.82%,共获得了芦笋Ao SPL14a基因编辑T_0代植株18株,其中,纯合突变体、双等位突变、杂合突变和嵌合突变分别有1、1、3和13株,其中预测基因功能缺失的突变体10株,包括稀有的“三等位”SNP嵌合突变体1株;突变体基因分型结果表明,共有25个突变类型,最常见的是碱基缺失,占71.28%,插入突变和复合突变百分比分别为25.39%和3.33%,插入突变主要是1个碱基插入。突变体表型鉴定结果显示,2株株龄18个月和2株株龄6个月的功能缺失嵌合突变体的株高显著降低,茎粗显著减小;相比野生型对照,2个月苗龄的纯合与双等位突变体株高变矮。基因敲除突变体表型变化结果表明,CRISPR/Cas9介导的Ao SPL14a基因定向突变改变了芦笋株型,进一步证实Ao SPL14a是调节芦笋株型和茎粗的重要功能基因。(3)针对芦笋Y染色体非重组的性别决定区域大部分是半合子的特性,为进一步验证芦笋CRISPR/Cas9基因编辑效率和拓宽应用范围,促进半合子功能基因开发与利用,靶向编辑芦笋Y染色体非重组区性别决定基因SOFF和asp TDF1。构建SOFF和asp TDF1单基因敲除CRISPR/Cas9表达载体各2个,分别转化芦笋XY雄性单株‘X7’胚性愈伤组织,再生植株阳性检测与基因分型结果显示,SOFF和asp TDF1各有1个sg RNA导致靶基因发生编辑,再生植株基因编辑效率分别为36.36%、60.00%。SOFF基因编辑共获得1株纯合突变体和3株嵌合突变体幼苗,共检测出10个突变类型;asp TDF1基因编辑共获得3株嵌合突变体幼苗,共检测出4个突变类型。首次实现了植物Y染色体非重组区域的半合子基因编辑。综上所述,本研究对芦笋株高、茎数、茎粗等株型性状进行了QTL定位与候选基因筛选,建立了芦笋CRISPR/Cas9基因组高效编辑技术,并通过该技术有效地定向突变Ao SPL14a基因改变了芦笋株型,证实了Ao SPL14a基因是调节芦笋株型的重要功能基因,同时获得了芦笋性别决定基因SOFF与asp TDF1的基因编辑材料。研究结果为揭示芦笋株型和性别决定的遗传基础及其分子机制、有效开展芦笋株型和性别控制育种,提供了新技术支撑、基因储备和材料基础。

小胶质细胞(Microglia,MG)是维持中枢神经系统稳态的重要细胞之一,在神经系统发育障碍疾病中起着重要的作用。有研究表明,孤独症的发https://www.selleck.cn/products/Rapamycin.html生与MG的炎性激活紊乱密切相关,短链脂肪酸(Short Chain Fatty Acids,SCFAs)作为肠道微生物的代谢产物,能够进入血脑屏障(BBB)调节MG的炎性激活状态,但SCFAs参与MG炎性调节及其对于孤独症MG的调节机制仍未阐明。本研究使用正常人来源的iPSC通过诱导其向中胚层、造血细胞祖细胞及MG分化的路径,建立了 iPSC来源MG的无饲养细胞、无血清的高效制备技术体系,解决了原代MG的取材困难、制备流程复杂的问题。该体系参照MG的系统发生的代谢通路,在诱导的第1-4天以中胚层特征基因HAND1的表达量为指标,确定了 iPSC向中胚层分化的SMAD途径激活因子BMP4和Wnt途径激活剂CHIR99021最适浓度及最佳组合;在诱导的第4-6天通过测定TBXT基因的表达效率,调整bFGF以及VEGF等细胞因子的浓度与milk-derived bioactive peptide配比,实现了向造血祖细胞的高效转化。流式检测可见中胚层细胞标志物KDR,和造血干细胞标志物CD34双阳性细胞群含量约为90%。诱导后第6-40天经SCF、IL-3、TPO、Flt3-Ligand、M-CSF及GM-CSF等细胞因子作用,获得了 MG祖细胞,流式检测结果显示MG祖细胞纯度大于90%;进一步MG祖细胞在IL-34、GM-CSF作用12天后获得了纯度大于95%(96.64%±1.33%)、细胞数量35±4.04倍于初始iPSC的成熟MG。间接免疫荧光及流式鉴定结果均表明,该MG表达IbaI、CX3CR1、P2RY12、CDselleck11b及CD1 1c等MG标志物。经IFN-γ、LPS等分子刺激,所分化的MG具有向M1状态极化的潜能以及吞噬大肠杆菌的吞噬功能。通过对该体系第0、4、6、14及40天的细胞转录组数据进行主成分分析(PCA)及GO分析,显示出明确的iPSC-中胚层-造血祖细胞-MG分化路径。通过与人外周血来源的巨噬细胞、人原代MG的转录组数据的聚类分析结果表明,该体系分化的MG与人原代MG具有较高相似性。进一步,本研究构建了 CHD8基因双位点突变的孤独症患儿来源的iPS细胞株并进一步制备了相应的MG;并观察了肠道微生物代谢产物SCFAs对其炎性应答的影响,发现SCFAs处理后能显著减轻LPS、IFN-γ对MG的炎症激活作用及吞噬活性,降低M1型激活状态对神经元的损伤;进一步的研究发现抑制单羧酸转运蛋白(MCT1/MCT4)的表达可以逆转单链脂肪酸处理对神经元的保护作用,显示MCT4在SCFAs对M1型MG的功能的调节作用中起着重要作用。不同来源转录组数据分析表明,MCT4基因的表达水平在孤独症患者中明显增高,提示MCT4可能是造成孤独症患者与健康人MG接受SCFAs调节能力存在差异的原因之一。总之,本研究建立了无饲养细胞、无血清的人iPSC来源的MG的制备技术体系,所制备的细胞具有均一性强、产率高、其转录组与原代MG具有较高相似性且可以与相应的神经类器官共生的优点,为进一步研究MG与神经元的相互作用提供了一种实验手段;同时本研究探讨了 SCFAs对不同遗传背景的MG的极化能力及免疫调节能力的影响,首次提出了 MCT4基因在肠道菌群代谢物通过调节MG的生物学功能、保护神经元的作用中的关键作用;为神经发育紊乱疾病的病因学研究、寻找疾病客观指标及干预手段提供了一种有效的模型选择。