Csi-miR159a-DUO1模块调控柑橘花粉发育的功能及分子机制解析

无核是衡量柑橘果实品质最重要的指标之一。花粉发育异常导致的雄性不育是果实无核性状形成的重要原因。miRNAs在花粉发育中起重要作用,挖掘和验证调控花粉发育的miRNA对柑橘育种Roxadustat体外和品种改良具有重要意义。本研究发现一个调控柑橘花粉发育的csi-miR159a,其在雄蕊中表达量较低。以‘奉节72-1’为材料,利用RLM-RACE技术扩增出csi-miR159a的编码基因CsMIR159A全长,通过遗传转化在番茄和山金柑中超表达csi-miR159a,验证其参与调控种子和果实发育。5’RACE验证csi-miR159a对DUO1的靶切,通过CRISPR/Cas9敲除山金柑DUO1的表型鉴定和授粉实验,确定DUO1是csi-miR159a调控柑橘花粉育性的关键靶基因。基于超表达csi-miR159a和敲除DUO1转基因阳性材料,利用生理生化指标测定、细胞学观察、转录组测序、DNA亲和纯化SCH772984浓度测序(DAP-seq)等方法,解析csi-miR159a通过调节花粉发育调控柑橘种子和果实发育的分子机制。主要研究结果如下:1.csi-miR159a及其靶基因表达模式特征5’RACE和烟草瞬时表达实验验证DUO POLLEN 1(DUO1)、GAMYB、NOZZLE(NZZ)是miR159a靶基因。RT-qPCR分析表明csi-miR159aproperty of traditional Chinese medicine在柑橘不同组织和果实发育不同时期均有表达,在雄蕊中表达量较低,果实发育早期表达量较高。DUO1的表达模式与GAMYB相似,在叶片、雄蕊和雌蕊的表达量相对较高,与csi-miR159a的表达模式相反。NZZ的表达量在叶片中几乎检测不到,但在雄蕊中显著高于其他组织和果实不同发育时期。2.csi-miR159a调控种子和果实发育的功能验证利用RLM-RACE技术扩增出csi-miR159a的编码基因CsMIR159A全长,CsMIR159A不含内含子结构。通过遗传转化将携带miR159a前体的超表达载体转入番茄。在番茄中异源超表达csi-miR159a导致果实无核,且转基因番茄系果实纵径、横径、单果重均显著低于野生型。番茄中异源表达csi-miR159a初步验证其参与调控种子和果实发育。3.柑橘中CRISPR/Cas9体系构建及优化为更好的解析基因功能,在山金柑中建立高效的双靶点CRISPR/Cas9编辑系统。本研究优化了CRISPR/Cas9体系载体构建方法,以DUO1为靶标,研究了不同双元T-DNA载体对CRISPR/Cas9系统编辑效率的影响,结果表明基于p K7WG2D载体的CRISPR/Cas9系统实现山金柑基因组高效编辑,编辑效率达到66.7%。基于优化的CRISPR/Cas9体系,以NZZ为靶标,实现山金柑基因组片段高效敲除。4.miR159a-DUO1模块通过调节花粉发育调控柑橘种子和果实发育山金柑中超表达csi-miR159a(miR159a-OE)和敲除Fh DUO1(Fh DUO1~(CR))均导致柑橘果实无核,且果实纵径、横径、单果重均显著低于野生型。miR159a-OE系和Fh DUO1~(CR)系花粉塌陷、花粉活力和萌发率都显著降低,并且在花粉发育前期淀粉未积累、后期未降解。此外,miR159a-OE系和Fh DUO1~(CR)系小孢子无法完成第一次有丝分裂(PM I)。WT花粉对miR159a-OE系和Fh DUO1~(CR)系进行授粉,结果表明miR159a-DUO1模块调控柑橘花粉育性。花药转录组分析表明,生长素合成基因YUC2和YUC6、生长素响应基因IAA9、淀粉合成基因SS4、糖转运基因STP8和STP14的表达量在miR159a-OE系和Fh DUO1~(CR)系单核花粉败育前期和单核花粉败育时期显著下调。单核花粉败育阶段,miR159a-OE系和Fh DUO1~(CR)系花药中生长素含量显著下降。DAP-seq、酵母单杂和EMSA实验结果表明,DUO1与YUC2、YUC6、IAA9、SS4、STP8和STP14启动子互作。上述结果揭示DUO1通过调控YUC2和YUC6的表达调节生长素的积累,进而调控花粉第一次有丝分裂;另一方面,DUO1通过调控SS4、STP8和STP14的表达来调节花粉中淀粉和糖的积累,进而调控花粉的发育。因此,miR159a-DUO1作为一个中央调控模块,整合生长素代谢、淀粉和糖代谢途径,通过调节柑橘花粉的发育,调控柑橘种子和果实的发育。综上所述,本研究解析了miR159a-DUO1模块通过调节花粉发育调控柑橘种子和果实发育的分子机制,为柑橘育种和改良提供了基因资源和理论依据。

美式咖啡中碳量子点毒性大小和致细胞毒性机制研究

碳量子点(carbon quantum dots,CQDs)是一种碳基纳米材料,热加工食品中含有CQDs,且有一定的毒性,但其形成和致毒机制有待研究。我们用210℃烘焙咖啡豆5 min、10 min和20 min,从E7080中提取并纯化了CQDs,对其形态大小、元素组成、官能团和荧光性质进行测定,并分析了CQDs的毒性大小。结果表明CQDs呈球形,且大小均匀。CQDs主要由C、O、N三种元素组成,CQDs表面基团主要由羟基、甲基、亚甲基、羰基、醚键等组成。X射线衍射结果证实CQDs为非晶态。细胞毒性实验的结果表明咖啡豆烘焙时间越长,CImmune ToleranceQDs尺寸越小,毒性越大。Caspase抑制剂ZVAD-FMK的加入并不会显著降低细胞的凋亡率和死亡率,这表明CQDs致细胞死亡方式为非Caspase依赖的细胞死亡。NRK细胞经CQDs处理后,结果显示,CQDs能降低溶酶体酶的活性和溶酶体的酸性程度,并使RIPK1和RIPK3的蛋白质水平升高。根据以上结果我们推测CQDs通过破坏溶酶体,引起溶酶体依赖的细胞死亡,并通过抑制RIPK1和RIPK3在溶酶体中的降解,放大细胞死亡信号。综上所述,我们阐明了烘焙咖啡中CQDs的毒性大小和致细胞毒性机制。为咖啡的安全生产提供基础,为食源性纳米材料的深入认识提供了参购买SAG考。

加减参苓白术散联合盐酸特比萘芬对脾虚型复发性外阴阴道假丝酵母菌病临床疗效的影响

目的:研究加减参苓白术散联合盐酸特比萘芬对脾虚型复发性外阴阴道假丝酵母菌病(RVVC)临床疗效的影响。方法:选取脾虚型RVVC患者90例,随机将其Bemcentinib供应商分为对照组、治疗1组(盐酸特比萘芬组)及治疗2组(中药联合组),每组各30例。对照组采用伊曲康唑分散片口服治疗,治疗1组采用盐酸特比萘芬片口服治疗,治疗2组即在治疗1组的基础上增加中药汤剂参苓白术散加减。比较3组治疗前后临床疗效、阴道生态指标变化(过氧化氢、白细胞脂酶、唾液酸酶)及随访3、6个月的复发情况和selleck化学不良反应发生率。结果:经治疗,治疗2组总有效率为93.1%,明显高于对照组的82.14%、治疗1组的82.76%(P<0.05)。治疗前3组阴道生态指标比较,差异无显著性(P>0.05)broad-spectrum antibiotics;治疗后治疗2组阴道生态指标评分阳性率及停药后3、6个月复发率明显低于治疗1组和对照组。结论:加减参苓白术散联合盐酸特比萘芬可有效改善脾虚型RVVC临床症状,治疗效果显著,副作用小,复发率低,为RVVC诊治提供了新思路。

慢性阻塞性肺疾病合并侵袭性肺曲霉病临床特征分析及危险因素探究

目的:探讨慢性阻塞性肺疾病继发侵袭性肺曲霉病的临床特点,以及潜在的危险因素,提高临床工作者对该病的认识及防治。方法:收集45例COPD合并IPA患者的相关数据,该组为COPD-IPA组。此外随机选择同期因COPD住院但未合并IPA的患者45例作为对照组(COPD对照组)。所有患者临床资料均从病历中提取,分析COPD-IPA组和COPD对照组基础合并症、呼吸系统症状及体征、实验室指标、影像学表现、相关病原学Roxadustat临床试验结果、相关治疗措施及转归数据,同时将相关危险因素纳入Logistic回归分析,探索COPD继发IPA的潜在危险因素。结果:1、经单因素分析,与COPD对照组相比,COPD-IPA组患者在住院时长≥2周,低蛋白血症、全身使用激素、使用抗生素≥clathrin-mediated endocytosis2周、使用抗生素≥3种、入住ICU等因素占比多,且有统计学差异(P<0.05)。2、通过多因素Logistic回归分析发现,低蛋白血症、全身使用激素、使用抗生素≥2周、使用抗生素≥3种是COPD患者继发IPA的危险因素(P<0.05)。3、COPD-IPA组最常见的主诉为胸闷(40例,88.9%),其次为咳嗽咳痰、发热、咯血等,胸痛较少见,此外发热、咯血、乏力、体重下降在COPD-IPA组中更常见,且差异具有统计学意义(P<0.05)。4、与COPD对照组相比,COPD-IPA组的WBC、NE、NE%、CRP、LDH均升高,而ALB、Hb则表现下降,其差异均有统计学意义((P<0.05))。5、COPD-IPA组的影像学表现以气道侵袭的征象为主,如表现为结节、气管壁增厚或狭窄、胸腔积液、树芽征等。6、COPD继发IPA的曲霉菌病原学以烟曲霉为主(23例,51.1%),其次为黄曲霉、黑曲霉、米VE-822供应商曲霉、土曲霉。7、肺泡灌洗液培养、肺泡灌洗液宏基因组二代测序(BALF-mNGS)的阳性率均高于痰培养。结论:1、当COPD患者有低蛋白血症、全身使用激素、抗生素使用≥3种,抗生素使用时间≥2周等相关临床因素时,更有可能继发IPA。2、COPD合并IPA临床表现以咳嗽咳痰、胸闷、咯血、发热常见,其中合并咯血症状时,需高度警惕IPA的发生。3、COPD合并IPA的胸部影像学CT以气道侵袭的非特异性征象为主。

柘树黄酮醇糖苷生物合成关键酶的功能研究

黄酮类化合物是广泛分布于植物中的一类次生代谢产物,具有调控植物生长素运输、雄性育性、对UV-B照射的保护、参与花和果实的着色、共生体吸引和授粉昆虫的招募等功能,同时黄酮类化合物参与植物对特定激素的反应。黄酮类化合物对人体健康具有广泛的益处,其中黄酮醇及其糖苷衍生物已被证实具有抗氧化、抗肿瘤、心血管保护等药理作用。黄酮糖苷在植物中广泛存在,其中数量最多的是黄酮醇氧苷,糖基化通常是天然产物修饰的最后一步,糖基化可以提高黄酮类化合物的水溶性,从而提高其生物利用度,并且利用植物糖基转移酶酶催化和工程菌转化等方法生产黄酮类化合物葡萄糖苷相对经济和方便,具有较大的应用前景。桑科植物柘树(Cudrania tricuspidata)中含有大量黄酮类化selleck PEG300合物,但柘树中黄酮类化合物生物合成途径尚未被解析,本研究主要关注于黄酮醇糖苷的生物合成,黄烷酮经F3H(Flavanone 3-hydroxylase)催化生成二氢黄酮醇,接着被FLS(Flavonol synthase)催化生成黄酮醇,黄酮醇被 UGT(UDP-Glycosyltransferase)糖基化生成对应的糖苷。本研究旨在鉴定柘树黄酮醇糖苷合成关键酶F3H、FLS以及UGT并对它们的催化特性进行研究,为黄酮醇糖苷的生物合成提供候选基因,开展了以下研究:1.柘树F3H和FLS的基因克隆与功能研究在柘树转录组数据库功能注释表中搜索关键词“flavone 3-hydroxylase”,结合生物信息学分析筛选得到F3H和FLS候选基因,异源表达的重组蛋白进行体外酶活功能验证,CtrF3H1、CtrF3H2具有黄烷酮3-羟化酶(F3H)的活性,能够催化柚皮素生成二氢山奈酚,CtrFLS具有黄酮醇合酶(FLS)的活性,催化二氢山奈酚生成山奈酚。底物选择性实验结果表明,CtrF3H1、CtrF3H2具有底物选择性差异,CtrF3H2具有更强的底物杂泛性,对柚皮素、圣草酚、橙皮素、甘草素四种黄烷酮有较强的催化活性,而CtrF3H1仅对柚皮素、圣草酚有较强的催化活性。通过氨基酸定点突变实现了 CtrF3H1底物杂泛性的增强,确定了影响CtrF3H1、CtrF3H2底物杂泛性的关键氨基酸位点。以CtrF3H1为代表研究了其在生物体内的功能,CtrF3H1在大肠杆菌内同样具有F3H的功能;进一步研究了CtrF3H1在植物体内的功能,结果表明,CtrF3H1转基因拟南芥较tt6植株黄酮醇山奈酚和槲皮素及黄酮金圣草素和芹菜素含量增加,表明CtrF3H1在植物体内发挥着 FNS Ⅰ(Flavone synthase Ⅰ)和 F3H 双功能。2.柘树UGT的基因克隆与功能研究在柘树转录组数据库功能注释表中搜索关键词“flavonoid 3-O-glucosyltransferase”,结合生物信息学分析筛选得到UGT候选基因,异源表达UGT重组蛋白,纯化蛋白以UICI 46474DP-葡萄糖为糖供体,以各类黄酮类化合物为底物进行体外酶活功能的探究,结果显示,CtrUGT1和CtrUGT2对多种黄酮类化合物具有糖基化的活性。CtrUGT1能够催化更多的黄酮类化合物并且具有更强的活性,且CtrUGT1具有分别催化3位、7位、3’位3个位置生成对应的单葡萄糖苷的活性,而CtrUGT2只能催化3位、7位2个位置糖基化。CtrUGT1在大肠杆菌体内同样具有更强的催化活性和效率,CtrUGT1可作为黄酮糖renal biomarkers苷生物合成候选基因。

利用一株新分离耐盐酵母A3在高盐条件下好氧降解偶氮染料的研究

本研究针对典型的环境污染物——偶氮染料,鉴于其难降解特性,同时常与高盐环境相伴随的实际情况,在综合分析比较了现有各类处理技术的基础上,提出利用真菌对其进行净化的方案。最新相关研究显示,属于子囊菌门真菌的酵母在有机污染物处理方面表现出诸多优势,但目前发现的可以降解偶氮染料的酵母Erastin说明书均需要较高浓度(最少2.0g/L)的糖作为共代谢基质。因此,还有待开发可以利用低碳源高效降解偶氮染料的耐盐酵母。基于上述分析,本研究旨在筛选可以利用较低浓度外加碳源且在高盐条件下高效降解脱色偶氮染料的酵母菌株,并对其进行系统表征,包括对其生长/降解条件进行优化,及其对偶氮染料的降解途径。此外,进一步分析目标菌株在染料和盐胁迫下的转录响应,从而尝试深入解析其代谢及耐盐机制。具体研究内容及主要结论如下:利用平板涂布法从海泥样品中分离得到一株耐盐酵母,经系统鉴定确定其为一株季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilPS-341核磁liermondii),命名为A3。酵母A3可以在外加碳源(葡萄糖或蔗糖)浓度低至1.0 g/L且含30.0 g/L Na Cl的高盐条件下高效降解trauma-informed care脱色多种类型的偶氮染料,其中对酸性红B(ARB)的降解速率最快。以ARB为目标物对其生长/降解条件进行了优化,得到最优条件为:葡萄糖(或蔗糖)浓度≥1.0 g/L,(NH_4)_2SO_4浓度≥0.2 g/L,酵母浸粉浓度≥0.04 g/L,盐度(Na Cl浓度)≤30.0 g/L,温度30-35℃,p H 6.0-7.0,摇床转速≥160 rpm。进一步推测了酵母A3对ARB的代谢途径。首先利用Microtox法评估了ARB在经过酵母A3降解前后的急性毒性变化,结果显示,经过8 h降解后产物的急性毒性反而略高于染料本身,说明生成了毒性更强的中间产物并发生了积累,但在经过12 h降解后急性毒性显著下降,说明此前积累的毒性中间产物被进一步分解为低毒性产物。检测了酵母A3胞内与偶氮染料及其中间产物降解相关的五种关键酶活性,结果显示,检出了包括木质素过氧化物酶(Li P)、锰过氧化物酶(Mn P)、漆酶(Lac)和依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的2,6-二氯靛酚钠(NADH-DCIP)还原酶在内的四种酶活性,但未检出偶氮还原酶(AZR)活性。其中可能参与偶氮染料脱色的是NADH-DCIP还原酶和Lac,而Li P和Mn P对后续中间产物的深度降解至关重要。四种酶的活性都会在高盐条件下被抑制,适宜浓度的染料则会诱导NADH-DCIP还原酶、Lac和Li P活性升高,但对Mn P活性并无明显影响。利用UV-Vis和HPLC-MS结合的手段分别检测出ARB主要官能团的变化及五种代谢中间产物,并由此推测了酵母A3对ARB的可能代谢途径,其中包括了偶氮键断裂、(芳香胺中间产物)单加氧加羟、氧化脱硫/脱氨、取代萘化合物的开环以及产物最终进入TCA循环等步骤。最后,利用比较转录组学手段探究了酵母A3在染料及盐胁迫条件下的转录响应,并尝试分析了其代谢及耐盐机制。结果显示,染料胁迫使一些与偶氮染料及其芳香类中间产物生物降解相关的氧化还原酶编码基因表达上调,同时还有一些编码糖转运蛋白的基因表达上调,佐证了染料胁迫诱导了酵母A3代谢活性(关键酶活性)升高的推论。另一方面,盐胁迫使与细胞壁组分调节相关的基因普遍上调,说明酵母A3的主要耐盐机制是依靠细胞壁调节,而同时发现与糖转运及氧化还原过程相关的基因表达普遍下调,印证了高盐度会抑制菌代谢活性的推论。

利用一株新分离耐盐酵母A3在高盐条件下好氧降解偶氮染料的研究

本研究针对典型的环境污染物——偶氮染料,鉴于其难降解特性,同时常与高盐环境相伴随的实际情况,在综合分析比较了现有各类处理技术的基础上,提出利用真菌对其进行净化的方案。最新相关研究显示,属于子囊菌门真菌的酵母在有机污染物处理方面表现出诸多优势,但目前发现的可以降解偶氮染料的酵母Erastin说明书均需要较高浓度(最少2.0g/L)的糖作为共代谢基质。因此,还有待开发可以利用低碳源高效降解偶氮染料的耐盐酵母。基于上述分析,本研究旨在筛选可以利用较低浓度外加碳源且在高盐条件下高效降解脱色偶氮染料的酵母菌株,并对其进行系统表征,包括对其生长/降解条件进行优化,及其对偶氮染料的降解途径。此外,进一步分析目标菌株在染料和盐胁迫下的转录响应,从而尝试深入解析其代谢及耐盐机制。具体研究内容及主要结论如下:利用平板涂布法从海泥样品中分离得到一株耐盐酵母,经系统鉴定确定其为一株季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilPS-341核磁liermondii),命名为A3。酵母A3可以在外加碳源(葡萄糖或蔗糖)浓度低至1.0 g/L且含30.0 g/L Na Cl的高盐条件下高效降解trauma-informed care脱色多种类型的偶氮染料,其中对酸性红B(ARB)的降解速率最快。以ARB为目标物对其生长/降解条件进行了优化,得到最优条件为:葡萄糖(或蔗糖)浓度≥1.0 g/L,(NH_4)_2SO_4浓度≥0.2 g/L,酵母浸粉浓度≥0.04 g/L,盐度(Na Cl浓度)≤30.0 g/L,温度30-35℃,p H 6.0-7.0,摇床转速≥160 rpm。进一步推测了酵母A3对ARB的代谢途径。首先利用Microtox法评估了ARB在经过酵母A3降解前后的急性毒性变化,结果显示,经过8 h降解后产物的急性毒性反而略高于染料本身,说明生成了毒性更强的中间产物并发生了积累,但在经过12 h降解后急性毒性显著下降,说明此前积累的毒性中间产物被进一步分解为低毒性产物。检测了酵母A3胞内与偶氮染料及其中间产物降解相关的五种关键酶活性,结果显示,检出了包括木质素过氧化物酶(Li P)、锰过氧化物酶(Mn P)、漆酶(Lac)和依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的2,6-二氯靛酚钠(NADH-DCIP)还原酶在内的四种酶活性,但未检出偶氮还原酶(AZR)活性。其中可能参与偶氮染料脱色的是NADH-DCIP还原酶和Lac,而Li P和Mn P对后续中间产物的深度降解至关重要。四种酶的活性都会在高盐条件下被抑制,适宜浓度的染料则会诱导NADH-DCIP还原酶、Lac和Li P活性升高,但对Mn P活性并无明显影响。利用UV-Vis和HPLC-MS结合的手段分别检测出ARB主要官能团的变化及五种代谢中间产物,并由此推测了酵母A3对ARB的可能代谢途径,其中包括了偶氮键断裂、(芳香胺中间产物)单加氧加羟、氧化脱硫/脱氨、取代萘化合物的开环以及产物最终进入TCA循环等步骤。最后,利用比较转录组学手段探究了酵母A3在染料及盐胁迫条件下的转录响应,并尝试分析了其代谢及耐盐机制。结果显示,染料胁迫使一些与偶氮染料及其芳香类中间产物生物降解相关的氧化还原酶编码基因表达上调,同时还有一些编码糖转运蛋白的基因表达上调,佐证了染料胁迫诱导了酵母A3代谢活性(关键酶活性)升高的推论。另一方面,盐胁迫使与细胞壁组分调节相关的基因普遍上调,说明酵母A3的主要耐盐机制是依靠细胞壁调节,而同时发现与糖转运及氧化还原过程相关的基因表达普遍下调,印证了高盐度会抑制菌代谢活性的推论。

孢子丝菌病全转录组分析及JAK/STAT信号通路功能相关研究

背景:孢子丝菌病(Sporotrichosis)是一种全球广泛分布的由孢子丝菌复合体(Sporothrix complex)引起的累及皮肤、皮下组织、粘膜及局部淋巴系统的慢性感染性疾病,可播散至全身,引起系统性损害。我国是人孢子丝菌病的高发国家,尤其是东北地区,孢子丝菌病是一个比较严重公共卫生问题。目前,孢子丝菌病临床治疗手段仍然很有限,主要包括免疫调节剂碘化钾和各类抗真菌药物,治疗既耗时又昂贵,且患者主要分布在农村地区,治疗存在较PS-341半抑制浓度高的经济成本和时间成本。因此,深入研究孢子丝菌病的发生发展机制,探索新的可靠有效的治疗靶点,是当前该研究领域的热点和亟待解决的关键问题。转录组学测序在RNA水平研究基因表达的情况,发现在细胞或组织内异常表达的mRNA、lncRNA和miRNA,并可对编码和非编码基因间的互作网络进行分析,有助于深入理解疾病的病理生理机制,是探索疾病发生发展及开发诊断治疗靶点的重要研究方法。在本研究中,我们通过全转录组学测序,发现在孢子丝菌病患者皮损组织中异常表达的lncRNA有671个,mRNA有3281个,miRNA有214个,使用Cytoscape软件构建ceRNA网络,确定了核心lncRNA、miRNA和mRNA分子。此外,进行GSEA基因富集分析,发现多个信号通路相关基因在孢子丝菌病患者皮损组织中富集,包括Toll样受体信号通路、NK细胞介导的细胞毒作用、T细胞受体信号通路、NOD样受体信号通路和JAK/STAT信号通路。其中,JAK/STAT信号通路在孢子丝菌Bio-mathematical models病患者皮损组织中明显富集,我们利用RT-qPCR和Western Blot实验,验证JAK/STAT信号通路相关基因在孢子丝菌病患者皮损组织中的表达情况,结果显示在孢子丝菌病患者皮损组织中SOCS3、IL-6、JAK3、p-JAK3和STAT3、p-STAT3蛋白表达水平显著升高。最后,应用免疫组织化学方法进一步验证孢子丝菌病患者皮损组织中JAK3及其磷酸化蛋白的表达情况,分析JAK3表达与疾病临床特征的相关性,结果表明,JAK3及其磷酸化蛋白在孢子丝菌患者皮损组织中表达显著高于正常皮肤,且在淋巴管型中表达更为明显。综上所述,本研究通过全转录组学测序,对孢子丝菌病患者皮损组织样本进行检测分析发现与孢子丝菌病相关的mRNA、lncRNA和miRNA,以及多个ceRNA调控网络,并进一步结合临床样本检测,验证JAK/STAT信号通路在孢子丝菌病患者皮损组织中显著激活,提示JAK/STAT信号通路可能参与调控孢子丝菌病的发生发展过程,为进一步探究孢子丝菌病的发生发展机制和开发新的治疗靶点提供了理论基础和数据支持。方法:1.收集孢子丝菌病患者的皮损组织,以皮肤外科整形患者重眼睑术中切取的正常皮肤组织为对照,用Trizol提取组织内总RNA,分别构建长链RNA转录组文库和miRNA转录组文库并进行全转录组测序。2.对测序原始数据进行质量预处理和数据过滤后,先用主成分分析(principal component analysis,PCA)进行样本间的比较,然后使用DEseq2方法以|log2FC|≥1、矫正P值<0.05为阈值作为筛选条件筛选差异表达基因。3.对筛选得到的差异表达基因(包括lncRNA、mRNA和miRNA)进行GO预测(Gene Ontology)、KEGG分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)以及GSEA基因富集分析(Gene Set Enrichment Analysis),分析与孢子丝菌病发生发展相关的关键基因和主要信号通路。4.对于转录组测序发现的异常表达lncRNA,我们利用miRcode/lnc Base两个数据库通过分析预测其靶miRNA,再使用RNAHybrid/miRTar Base/Target Scan三个数据库分析得到差异miRNA的靶基因mRNA。最后通过得到的异常表达lncRNA-交集miRNA-交集mRNA,使用Cytoscape软件构建ceRNA网络,确定在孢子丝菌病中异常表达的核心lncRNA、miRNA和mRNA分子。5.选取DKK1、ACTG2、JAK3和SLC7A11四个差异基因。经RT-qPCR在孢子丝菌病患者皮损组织和健康正常皮肤对照组织中进行表达验证,验证测序结果。6.选取在孢子丝菌病中显著富集的JAK/STAT信号通路作为研究对象,利用RT-qPCR检测该通路相关基因IL-6、JAK3、SOCS3和STAT3在孢子丝菌病患者皮损组织和健康正常对照组织中的表达情况。进一步通过Western Blot检测JAK/STAT信号通路中IL-6、SOCS3、JAK3和STAT3的表达情况和磷酸化水平,明确JAK/STAT信号通路在孢子丝菌病患者皮损组织中的激活情况。7.通过免疫组化检测孢子丝菌病患者皮损组织中JAK3及其磷酸化蛋白的表达情况,分析JAK3及其磷酸化蛋白的表达与疾病临床特征的相关性,进一步探讨JAK3在孢子丝菌病发生发展中的作用。结果:1.共收集了15例患者(男性5名,女性10名)皮损组织样本和5例(男性2名,女性3名)健康正常对照皮肤组织样本,其中5例病例样本和3例对照样本用于全转录组测序。长链RNA测序一共检测到123185个基因,其中mRNA18561个,lncRNA 51706个,circ RNA 45866个。miRNA测序一共检测到1939个基因。2.PCA分析结果表明,孢子丝菌病患者皮损组织与健康正常对照组织中lncRNA、mRNA和miRNA表达谱存在显著差异。进一步分析结果显示,在孢子丝菌病患者皮损组织中表达水平显著异常的lncRNA总数为671RSL3生产商个,其中有392个表达水平升高,279个降低;mRNA总数为3281个,其中有1693个表达水平升高,1588个降低;miRNA总数为214个,其中有99个表达水平升高,115个降低。3.GO预测发现,在孢子丝菌病皮损组织中表达水平显著降低的mRNA主要参与cell matrix adhesion、neural crest cell migration、Wnt signaling pathway等生物学过程,参与构成node of Ranvier、receptor complex、cytoskeleton等细胞组分,行使sequence-specific DNA binding、growth factor binding、nitric-oxide synthase binding等分子功能;而表达水平显著升高的mRNA主要参与B cell receptor signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、chemokine-mediated signaling pathway等生物学过程,参与构成lysosome、MHC class I protein complex、tertiary granule lumen等细胞成分,具有NAD+nucleosidase activity、C-C chemokine receptor activity、non-membrane spanning protein tyrosine kinase activity等分子功能。KEGG分析结果表明在孢子丝菌病皮损组织中表达水平降低的mRNA主要参与c AMP signaling pathway、Hippo signaling pathway、TGF-beta signaling pathway和Wnt signaling pathway等信号通路,而表达水平升高的mRNA主要参与NOD-like receptor signaling pathway、Natural killer cell mediated cytotoxicity、Antigen processing and presentation和NF-kappa B signaling pathway等;在人类疾病分类中主要是与Infectious disease、Immune disease等有关,在宿主系统中主要是与Immune system、Endocrine system以及Digestive system有关;表达水平降低的miRNA主要参与c AMP signaling pathway、Primary immunodeficiency、HIF-1 signaling pathway以及Peroxisome等,表达水平升高的miRNA主要参与Lysosome、Primary immunodeficiency、p53 signaling pathway和PI3K-Akt signaling pathway等;在人类疾病分类中主要是与Infectious disease、Immune disease等有关,在宿主系统中主要是与Immune system、Endocrine system以及Sensory system有关。GSEA富集分析结果表明在孢子丝菌病皮损组织中表达异常的mRNA主要富集在Natural killer cell mediated cytotoxicity、Antigen processing and presentation、Primary immunodeficiency、Toll-like receptor signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway、Apoptosis、JAK/STAT signaling pathway等信号通路。4.将异常表达miRNA靶向的mRNA与异常表达的mRNA取交集,对得到的mRNA进行KEGG分析,结果显示交集mRNA主要参与JAK/STAT signaling pathway、TNF signaling pathway以及Phagosome等信号通路调控。ceRNA网络分析表明核心lncRNA有LOC105374338、LOC105370792、URS0001BCE66F等,核心miRNA有miR-143-5p、miR-20b-5p、miR-31-5p、miR-1268a等,核心mRNA有JAK3、SLC4A1、ESR1、GAMT等。5.选取13例临床样本,其中孢子丝菌病患者皮损组织8例,健康正常皮肤对照组织5例。用Trizol提取组织mRNA,进行RT-qPCR检测DKK1、ACTG2、JAK3和SLC7A11的表达水平。结果显示,与健康正常皮肤对照组相比,在孢子丝菌病患者皮损组织中DKK1和ACTG2的表达水平显著降低,JAK3和SLC7A11的表达水平显著升高,这与全转录组学测序结果完全一致。6.提取8例孢子丝菌病患者皮损组织与5例健康正常皮肤对照组织的mRNA和总蛋白质,利用Western Blot和RT-qPCR实验检测JAK/STAT信号通路相关蛋白的表达情况。结果显示,在孢子丝菌病患者皮损组织中,SOCS3、IL-6和JAK3的mRNA表达水平显著高于健康对照组织,而STAT3的mRNA表达水平则没有明显变化;Western Blot实验发现SOCS3、IL-6、JAK3和STAT3蛋白在皮损组织中表达水平显著高于对照组织,JAK3和STAT3磷酸化水平也明显高于对照组织,说明JAK/STAT信号通路在孢子丝菌病患者皮损组织中显著激活。7.收集30例孢子丝菌病患者皮损组织的石蜡切片,9例健康正常皮肤组织石蜡切片,通过免疫组织化学技术检测JAK3及其磷酸化蛋白在两组皮肤组织中的表达情况,结果发现JAK3及其磷酸化蛋白在孢子丝菌病患者皮损组织中表达水平显著高于健康正常皮肤对照组织,且在淋巴管型患者皮损中的表达水平显著高于固定型,但与病程无显著相关性。结论:1.孢子丝菌病患者皮损组织与健康正常皮肤组织的转录谱明显不同,其中在孢子丝菌病患者皮损组织中表达水平显著异常的lncRNA有671个,mRNA有3281个,miRNA有214个。2.在孢子丝菌病患者皮损组织中表达水平显著异常的基因与感染性疾病及免疫反应相关疾病有关,主要的相关信号通路包括Toll样受体信号通路、NK细胞介导的细胞毒作用、T细胞受体信号通路、NOD样受体信号通路和JAK/STAT信号通路。本研究构建了孢子丝菌病ceRNA调控网络关系,获得核心mRNA(JAK3、SLC4A1、ESR1、GAMT)、核心lncRNA(LOC105374338、LOC105370792、URS0001BCE66F)以及核心miRNA(miR-143-5p、miR-20b-5p、miR-31-5p、miR-1268a)。3.在mRNA和蛋白质表达水平上对JAK/STAT信号通路相关分子进行验证,孢子丝菌病患者皮损组织中SOCS3、IL-6和JAK3的mRNA表达水平显著升高,SOCS3、IL-6、JAK3和STAT3蛋白表达显著上调,JAK3和STAT3蛋白磷酸化水平也明显高于健康正常对照皮肤组织。明确JAK/STAT信号通路在孢子丝菌病皮损组织中显著激活,提示其可能参与孢子丝菌病的发生发展过程。4.孢子丝菌病患者皮损组织中JAK3及其磷酸化蛋白表达量较健康正常皮肤对照组显著升高,且淋巴管型患者皮损组织中JAK3和p-JAK3的表达水平明显高于固定型,进一步证明了JAK3作为关键分子参与了孢子丝菌病发生发展,且在淋巴管型中更为活跃。

IL-6预测改良无抽搐电休克治疗伴自杀意念的老年抑郁症的疗效分析

目的 探讨基线白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素6(IL-6)水平对伴自杀意念的老年抑郁症患者改良无抽搐电休克治疗(MECT)疗效的预测作用。方法 选取2021年6月1日至2022年5月31日于首都医科大学附属北京安定医院老年精神科住院的58例伴自杀意念(自杀意念自评量表评分≥12分)的老年抑郁症患者为研究对象,所有患者进行MECT治疗。收集患者治疗前、治疗2周末的血液标本及一般资料,测定基线IL-1β和IL-6水平,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析基线IL-6水平的cut-off值,采用二项Logistic回归分析基线IL-6水平与MECT疗效的影响因素。结果 MECT治疗2周末,53.4%(31/58)的患者确认细节治疗有效,46.6%(27/58)的患者治疗无效;8Panobinostat溶解度9.7%(52/58)的患者未检测出IL-1β。有效组患者的男性占比低于无效组患者[25.8%(8/31)比51.9%(14/27)],基线IL-6水平高于无效组患者[10.11(0,38.94)pg/ml比0(0,6.46)pg/ml],差异均有统计学意义(χ~2=4.15Patent and proprietary medicine vendors8、Z=-2.925;P<0.05)。基线IL-6水平预测MECT疗效的ROC曲线下面积为0.714(95%CI=0.576~0.852),基线IL-6水平cut-off值为7.49 pg/ml,对疗效预测的敏感度为0.677,特异度为0.815。二项Logistic回归分析显示,男性(OR=0.147,95%CI=0.025~0.874,P<0.05)和基线IL-6水平≥7.49 pg/ml(OR=17.261,95%CI=2.966~100.440,P<0.01)是伴自杀意念的老年抑郁症患者MECT治疗有效的危险因素。结论 在老年抑郁症伴发自杀观念的治疗中,血清基线IL-6水平≥7.49 pg/ml与MECT疗效具有一定的关系,可用于预测伴自杀意念的老年抑郁症患者的预后。

水稻稀穗突变体lax1抑制子的鉴定及功能分析

水稻是重要的粮食作物,其有selleckchem AZD2281效分蘖数、每穗实粒数、粒重决定了单株的产量。穗形态建成的分枝数和着粒密度影响了每穗粒数,因此,开展穗形态建成的分子机制研究对水稻产量性状的遗传改良具有重要的理论及实践意义。LAX1(LAX PANICLE 1)在籼稻与粳稻品种之间呈现明显的单倍型差异,粳稻品种LAX1的SNP变异为LAX1~(T349G)时呈现稀穗表型,说明籼粳稻通过LAX1调控水稻穗分枝发育存在功能的分化。为解析籼粳稻LAX1调控穗形态建成的分子机制,本研究利用粳稻品种中花11号(ZH11)的lax1突变体与广亲和品种Dular创制了F_2群体,发现在Dular背景下存在一个可以抑制lax1-6突变表型的显性位点,将其命名为Suppressor of lax1(Slax1)。本论文对Slax1的功能及其与LAX1共同调节水稻穗形态建成的分子机制进行了探究,主要研究结果如下:1.Dular背景Slax1位点的初步定位和精细定位。我们发现在Dular背景下存在一个可以抑制ZH11背景lax1-6突变表型的显性位点Slax1。Slax1定位于7号染色体,候选基因LOC_07g46790,编码水稻歧化酶2(OsDPE2)。Dular和ZH11背景基因组间在OsDPE2编码区存在2个SNP可导致编码氨基酸序列Transbronchial forceps biopsy (TBFB)变异。2.OsDEP2基因的克隆和功能分析。互补试验结果表明OsDEP2~(Dular)可以抑制lax1-6突变表型。OsDPE2属于植物歧化酶2(DPE2)蛋白家族。OsDPE2定位于胞质。成熟叶和幼穗的原基分生区存在OsDPE2高水平表达。OsDPE2的表达水平随着昼夜变化呈现周期性节律震荡。ZH11背景下成熟叶和幼穗组织中存在较高水平的OsDPE2活力。3.OsDEP2通过淀粉代谢影响水稻生长发育OsDPE2活力受到昼夜节律变化影响,且OsDPE2活力的周期性变化也影响到叶片中淀粉和可溶性糖含量。OsDPE2影响黑暗条件下水稻植株生长速率。OsDPE2影响水稻穗枝梗和小花发育。4.OsDEP2与LAX1的调控关系。通过观察并分析lax1-6(m)osdpe2#01(H)、野生型背景LAX1基因超量表达、osdpe2#01背景LAX1超量表达、野生型背景OsDPE2超量表达和lax1-6背景OsDPE2超量表达等植株和穗表型,发现OsDPE2作为LAX1的下游基因参与调控水稻穗形态建成。LAX1可与OsDPE2基因上游启动子区顺式元件结合,且正调控OsDPE2基因表达。5.OsDEP2活力与水稻穗产量性状正相关。LAX1单倍型可划分为LAX1~(349T)和LAX1~(349G);OsDPE2单倍型可划分为OsDPE2~(4A992G)、OsDPE2~(4G992A)和OsDPE2~(4G992G)。LAX1/OsDEP2单倍型组合受到水稻育种选择。OsDPE2活性与水稻穗枝梗数和小花数呈正相关。本研究克隆了一个水稻中可以抑制粳稻背景LAX1突变体突变表型的基因OsDPE2,揭示了OsDPE2通过参与淀粉代谢途径调控水稻穗发育,但其下游受体糖信号分子参与穗发育的调控机PR-171 IC50理仍需深入研究。OsDPE2基因功能和LAX1/OsDPE2基因调控关系的研究有助于我们进一步理解产量相关因子的遗传基础,也为水稻分子育种提供了产量性状的品种改良分子标记。