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目的:研究盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)及其生物膜的抑制作用和相关机制。方法:本研究采用微量肉汤稀释法检测盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)及最低杀菌浓度(MInimum Bactericidal Concentration,MBC)。应用时间杀菌曲线观察盐酸小檗碱对铜绿假单伯菌的杀伤情况,连续诱导耐药法检测盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌对的耐药突变诱导情况。利用96孔板构建铜绿假单胞菌生物膜,采用结晶紫染色和共聚焦激光显微镜观察盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌生物膜的抑制和分散作用。利用膜通透性实验、活性氧释放、胞内ATP检测等多种手段探讨盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌的抗菌机制。应用红细胞溶血实验评估盐酸小檗碱的细胞毒性。在小鼠急性感染铜绿假单胞菌腹膜炎模型中,评估盐酸小檗碱在体内的抑菌效果。结果:盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌的MIC为128-256μg/m L,MBC在256-512μg/m L之间。与传统抗生素相比,盐酸小檗碱还具备细胞毒性低以及不易诱导耐药等特点。1MIC(128μg/m L)、1/2MIC(64μg/m L)、1/4MIC(32μg/m L)的盐酸小檗碱均ABT-263临床试验可以抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成,同时,对铜绿假单胞菌生物膜具有较好的分散作用。q-RT-PCR结果显示128μg/m L盐酸小檗碱作用铜绿假单胞菌后NVP-TNKS656研究购买QS相关基因相对表达量(psla、pela、gaca、gacs、rlsr)均得到明显下调。1MIC(128μg/m L)、1/2MIC(64μg/m L)盐酸小檗碱均可破坏铜绿假单胞菌细胞膜、释放活性氧以及减少细菌胞内ATP等多种方式发挥着抗菌作用。在小鼠腹膜炎模型中,20mg/kg的盐酸小檗碱能够显著抑制铜绿假单胞菌的生长,表现出良好的杀菌活性,同时能够occult hepatitis B infection明显降低炎症因子IL-6的释放。结论:在本次研究中通过体内体外实验发现盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌均表现出良好的抗菌活性。盐酸小檗碱可抑制铜绿假单胞菌生长,且靶向作用于细胞膜,通过提高细胞体内活性氧水平、降低细菌代谢水平等多种途径发挥对铜绿假单胞菌的抑菌作用。盐酸小檗碱可有效抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成,其可通过下调铜绿假单胞菌QS系统相关基因、生物膜相关基因的表达水平,实现对生物膜的抑制作用。盐酸小檗碱在小鼠腹膜炎感染模型中,表现出良好的抗菌效果和抑制炎症反应的作用,在急性腹膜炎感染治疗中具有较好的应用前景。

研究背景与目的:流行病学调查显示,我国冠心病的患病率及死亡率逐年升高,作为冠心病的重要诊疗手段,介入手术例数也呈逐年增加的趋势。目前冠心病介入首选穿刺入路为桡动脉入路,当桡动脉穿刺失败或不适用时首选替代途径为股动脉途径,但由于股动脉穿刺术后患者需严格卧床制动,对于患者来说舒适度较差,且术后大出血发生率较高,因而部分病人拒绝经股动脉穿刺行冠心病介入手术。经肱动脉入路行介入手术术后患者无需严格卧床制动,但临床多由于缺乏熟练操作者及术后病人肘关节活动致止血不良等因素造成其临床应用较少,且既往有研究表明通过对肘关节的有效制动可以缩短术后压迫时间并减少其术后并发症的发生。所以本研究旨在基于3D打印技术开发出一款具有良好生物安全性及力学性能的肘关节外固定支具,并初步评价其应用于经肱动脉行冠心病介入术后患者的疗效情况。材料与方法:1.材料生物安全性评价:(1)细胞regeneration medicine毒性试验:将0.2g/ml浸提比的支具及硅胶浸提液稀释至浓度为100%、50%、25%、12.5%作为试验组,然后将试验组以及阴性、阳性和空白对照组各100ul加入含生长情况良好的L929细胞的96孔板中,培养24小时后在显微镜下观察细胞形态及生长情况,然后以CCK-8比色法测定各组OD值。(2)皮肤刺激试验:将6只新西兰兔平均分为2组(支具组和硅胶组)各3只,备皮后24小时在对应部位敷贴支具块、硅胶块、阳性对照材料及阴性对照材料,24小时后揭下敷贴物并清洗干净残留物质,观察去除敷贴物后24h、48h及72h的对应部位皮肤情况。2.参照国家标准规范完成对不同镂空方式的力学性能检测,包括弯曲试验、压缩试验和冲击试验,确定最佳的镂空方式。3.重要参数确定:(1)选取20名健康志愿者先后佩戴肘关节屈曲0°、30°和屈曲45°的肘关节外固定支具12小时后回收舒适度评价表,确定最舒适的肘关节屈曲角度;(2)选取20名健康志愿者分别佩戴不垫硅胶垫和垫不同厚度硅胶垫(3mm、5mm、8mm)的肘关节外固定支具各12小时,比较各组舒适度及红肿压痕、水疱的差异,确定最佳的硅胶垫厚度。4.通过软件处理将CT数据转换为所NSC125066临床试验需要的CAD数据,并通过3D打印机采用熔融沉积成型工艺打印出所需的肘关节外固定支具。5.临床初步应用:选取经皮肱动脉穿刺行冠心病介入术后患者共40名,随机分为试验组/支具组和对照组/传统组,随访观察患者术后24h内的穿刺点压迫时间、疼痛程度、及相关并发症等指标,比较两组间的差异。结果:1.(1)细胞毒性试验:显微镜下观察100%支具组、50%支具组、25%支具组、12.5%支具组、100%硅胶组、50%硅胶组、25%硅胶组、12.5硅胶组细胞生长情况良好,与阴性对照和空白对照组比较未见明显增殖下降情况。阳性对照组细胞密度较其他组明显下降,可见细胞圆缩及溶解。CCK-8检测提示阳性对照组的OD值较空白对照组明显下降,差异具有显著统计学意义(P<0.01);100%支具组、50%支具组、25%支具组、12.5%支具组、100%硅胶组、50%硅胶组、25%硅胶组、12.5%硅胶组及阴性对照组的OD值与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。(2)皮肤刺激试验:在兔子取下敷贴物后24h、48h和72h分别对其敷贴部位进行观察,阳性对照部位可见明显红肿,部分伴焦痂形成;支具组、硅胶组及阴性对照部位未见明显红斑水肿。皮肤刺激评价,阳性对照部位皮肤反应类型为重度;支具组、硅胶组及阴性对照部位皮肤反应类型为极轻微。2.力学性能检测:弯曲试验:矩形镂空的最大载荷及弯曲强度较圆形和三角形镂空均更大(P<0.01);压缩试验:矩形镂空的最大载荷和压缩强度均比圆形和三角形镂空更大(P<0.01);冲击试验:圆形与矩形镂空的冲断试样时所消耗的功相比,差异没有统计学意义(P>0.05),但均较三角形镂空所消耗的功更多(P<0.05)。3.20名健康志愿者右上肢佩戴肘关节伸直位即肘关节屈曲0°,以及屈曲30°和45°的外固定支具各12小时,结果显示肘关节伸直位时舒适度较肘关节屈曲3PUN30119溶解度0°和屈曲45°均更差(P<0.01),肘关节屈曲30°和屈曲45°时患者舒适度差异无统计学意义(P>0.05);20名健康志愿者右上肢佩戴肘关节外固定支具时内衬加垫3mm、5mm、8mm厚度的硅胶垫及不垫硅胶垫(0mm)共12小时,对其舒适度及上肢红肿、压痕、水疱等情况进行统计分析,结果显示舒适度随硅胶垫厚度增加而增加,不垫硅胶垫舒适度较加垫3mm硅胶垫的舒适度更差,差异有显著统计学意义(P<0.01)。垫3mm硅胶垫的舒适度较垫5mm硅胶垫的舒适度更差,差异仍有统计学意义(P<0.05),加垫5mm硅胶垫与8mm硅胶垫的肘关节外固定支具舒适度差异无统计学意义(P>0.05);在红肿压痕方面,不垫硅胶垫与加垫3mm硅胶垫相比,差异无统计学意义(P>0.05),垫3mm硅胶垫较垫5mm硅胶垫的红肿、压痕情况更明显(P<0.01),垫5mm硅胶垫与垫8mm硅胶垫的红肿压痕情况相比差异无统计学意义(P>0.05),各组均未出现水疱;4.对支具组和传统组两组患者的一般临床资料进行比较,两组间性别、年龄、吸烟、饮酒、围术期抗血小板及抗凝药物使用情况的差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。两组患者术后穿刺点压迫时间支具组短于传统组(P<0.01);传统组术后24小时内的手臂疼痛程度较支具组明显(P<0.01);传统组术后患者上臂肿胀程度较支具组明显,差异有显著统计学意义(P<0.01);两组患者在术后前臂肿胀程度、皮下出血面积、出血分型、神经损伤、骨筋膜室综合征及彩超检查相关指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.本试验所用3D打印肘关节外固定支具材料及硅胶材料无细胞毒性和皮肤刺激性,具有较好的生物安全性。2.矩形镂空的力学性能最佳。3.佩戴肘关节屈曲30°及45°时舒适度更佳,考虑到肘关节屈曲角度对血管压迫器位置的影响,将肘关节外固定支具屈曲角度确定为30°;加垫5mm及8mm层厚硅胶垫的肘关节外固定支具舒适度最佳,为减轻病人负重的同时节约成本,将硅胶垫厚度确定为5mm。4.3D打印肘关节外固定支具可减轻经皮肱动脉穿刺行冠心病介入术后患者的疼痛程度,提高患者舒适度,并缩短穿刺点压迫时间,减轻上臂肿胀程度。

目前,癌症仍是威胁人类生命和健康的重要疾病之一。尽管传统的癌症治疗技术,例如手术切除、药物化疗、放射治疗等,提高了部分患者的生存率,但是由于肿瘤的复杂性和多变性,这些治疗方式仍不足以满足所有病人的需求。近年来,随着纳米技术的飞速进步,易于改性及功能化的纳米材料因其小尺寸效应、生物相容性和实体瘤的高渗透长滞留效应(enhanced permeability and retention,EPR)等独特优势被逐渐运用到肿瘤治疗中,并开发了一系列基于纳米技术的肿瘤治疗模式。声动力治疗(sonodynamic therapy,SDT)是一种利用超声波能量激活富集在病灶部位的声敏剂产生活性氧物质(reactive oxygen species,ROS)来杀死细胞的新型肿瘤治疗模式。与传统的光动力疗法相比,声动力疗法安全性高、具有良好的组织穿透能力,可以对肿瘤深部组织进行治疗。近年来,研究人员开发了各种类型的声敏剂用于SDT治疗肿瘤,并取得了一些满意的治疗效果。其中,无机纳米材料因其稳定性高、易于功能化、具有良好的生物相容性等特点,受到了研究者们的广泛关注。然而,大多数无机纳米材料受到本身结构的限制,导致声催化效率较低,需要通过其他策略来提升声动力性能。结合近年来的研究结果表明,依靠单一的治疗模式难以取得理想的疗效,所以通过多种治疗手段联用的多功能纳米平台已经成为肿瘤治疗的研究重点。在本论文中主要围绕发展新型声催化无机纳米材料用于声动力治疗研究。通过不同的策略来增强无机纳米材料的声敏化性能,并联合其他治疗手段,构建了用于声催化介导的多功能纳米复合治疗平台。主要研究内容包括以下两部分:(1)通过水热法合成了具有中空介孔的二氧化钛(TiO_2)纳米球,并将非金属氮化碳量子点(g-C_3N_4 QD)表面沉积到TiO_2上,随后封装化疗药物罗米地辛(Z-IETD-FMK浓度Romdepsin,RMD),最终形成了基于异质结构负载RMD的可超声激活的多功能纳米反应器(TCR),实现了声动力和化疗的联合疗法。后续通过各种体外表征手段评估各项理化性质。在细胞水平上,利用小鼠乳腺癌细胞探究TCR纳米复合材料产生ROS能力,通过实验结果表明该纳米复合材料在声动力治疗与化疗的联合作用下对肿瘤细胞显示出明显的毒性作用,诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡。同时,能够有效触发免疫原性细胞死亡。通过尾静脉注射后,TCR能通过medical equipmentEPR效应在肿瘤区域被动高效富集,在超声作用下产生ROS及控制RMD的释放,以此实现肿瘤的联合治疗。通过免疫检查点抑制剂(PD-L1抗体)联合治疗,可以有效抑制远端转移瘤及肺部转移,显示出优异的抗肿瘤能力。(2)有研究表明缺陷型无机纳米材料在保持良好生物相容性的同时,可以提升传统无机纳米材料的性能,增强其声催化的效率。由此我们通过二次煅烧的方法合成了一种具有声动力性能的铁锚定氮缺陷型纳米催化剂(FeN_v/CN)。然后通过体外结构表征及化学探针证实该缺陷型纳米催化剂的声敏化效率及催化性能,发现由于缺陷引起的能带Colforsin结构变化,增强了声动力产生ROS的能力。后续通过在表面修饰聚乙二醇(PEG)以及共价偶联小分子穿膜肽(cRGD),增加其血液循环时间以及主动靶向肿瘤的能力,得到了最终负载cRGD的缺陷型纳米复合材料(FPR)。随后通过细胞层面证实了在cRGD的存在下提高了细胞摄取能力。伴随着超声及催化产生大量ROS并消耗GSH,产生细胞毒性,并抑制谷胱甘肽过氧化物酶活性,破坏癌细胞内氧化还原平衡,最终导致脂质过氧化物累积,诱发铁死亡。通过体内实验结果表明,这种治疗方式可以诱导癌细胞发生免疫原性死亡,从而抑制肿瘤发生。该纳米平台可以有效提高肿瘤的治疗效果。

脓毒症是可证实的或怀疑的感染诱发的失调的宿主反应引起致命性的器官功能障碍,严重时可以致残甚至死亡。近几十年的证据显示全世界脓毒症发病率居高不下,尤其是ICU人群。尽管伴随着近几十年的医学进步,对于脓毒症的理解逐步深入,治疗也取得了较大进步,但报道的死亡率仍高达40%。脓毒症心功能障碍(sepsis-induced cardiac dysfunction,SICD)是脓毒症常见的并发症,表现为与冠脉血管支配区不匹配的可逆的心脏收缩功能障碍和或舒张功能障碍。SICD的患者死亡率可增加2-3倍,文献报道为70-90%。SICD的确切发病机制目前仍不清楚,并且临床缺乏有效的治疗措施。研究认为失衡的炎症反应和氧化应激产生心肌抑制因子,诱发Ca~(2+)调节紊乱、β肾上腺素能失衡、线粒体功能障碍、能量代谢改变,以及这些改变又反过来加重炎症反应和氧化应激失衡等均参与了心肌抑制、损伤及部分坏死,导致心脏功能障碍,但基于这些机制的干预在临床研究显示出的治疗价值有限,仍需要进一步的研究来深入的理解其发病机制,发掘有效治疗,以改善患者的预后。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS),包括经典RAAS途径和非经典RAAS途径。两种途径在心脏的多种类型细胞均有表达。血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)是经典RAAS途径的主要效应分子,具有促炎效应,可以诱发心肌肥大、纤维化和心室重构,最终导致心功能障碍。血管紧张素1-7(angiotensin 1-7,Ang 1-7)是非经典RAAS途径的主要效应分子,具有与Ang点击此处 II相反的效应,因而具有抗炎和心脏保护作用。脓毒症时RAAS系统经典途径激活,Ang II显著增高,上调肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-1(interleukin-1,IL-1),参与含pyrin域的NOD样受体家族蛋白3(nucleo-tide-binding domain,leucine-rich-repeat containing family,pyrin domain-containing 3,NLRP3)炎性小体激活,诱导白细胞浸润、微血管障碍和并参与脓毒症器官损伤包括心脏功能障碍。在脓毒症动物模型中,平衡RAAS系统可以控制过度的炎症反应,改善心功能和生存率。血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2),血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)的同源物,可以将具有促炎效应的Ang II裂解为具有抗炎效应的Ang 1-7,负向调节经典RAAS,对心脏有保护作用。重组人血管紧张素转换酶2(recombinant human ACE2,rh ACE2),已经被证实在炎性和非炎性心脏损伤模型中有心脏保护作用。而且出于安全的考虑,在rh ACE2对于急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)患者的临床试验中不仅显示出肺脏保护作用,还被证实对血流动力学没有抑制作用,可以被脓毒症ARDS患者和健康志愿者很好的耐受。NLRP3炎性小体,包含三个组成部分,分别是凋亡相关棘样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)、NLRP3和天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)前体,是介导固有免疫反应的重要途径,研究显示NLRP3炎性小体激活参与了SICD发生发展。研究显示Ang II可以通过核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)激活NLRP3炎性小体。因此,本研究旨在观察SICD患者Ang II血浆水平与SICD发生的相关性和对脓毒症患者预后的影响。采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)腹腔注射的方法建立小鼠SICD模型,探讨SICD小鼠血浆Ang II的变化;应用rh ACE2调控SICD小鼠的血浆Ang II浓度,观察对炎症反应、心肌损伤和左心收缩功能的影响,并进一步探究调控Ang II对SICD小鼠心肌NLRP3小体激活及下游效应和相关分子信号途径的影响,为深入理解SICD的发病机制及和探寻新的治疗方向提供理论依据。第一部分脓毒症患者血管紧张素II水平与脓毒症心功能障碍的相关性分析目的:观察SICD患者、无心功能障碍的脓毒症患者及非脓毒症患者血浆Ang II水平的差异,探讨脓毒症患者Ang II血浆水平变化特点及其与SICD的相关性。方法:入选2022年2月至2023年2月沧州市中心医院三家ICU脓毒症患者,根据是否发生SICD,分为脓毒selleck症组和SICD组,选择同期入住ICU的非脓毒症非心衰脑卒中患者为对照组。收集入组患者的基线临床资料;测定患者入院后第一个清晨的血浆Ang II和炎症因子水平包括IL-1β和TNF-α。床旁超声心动图测定心功能指标包括LVEF、LVFS和E/A。采用独立样本t检验、行列卡方检验、单因素方差分析或非参数检验,Pearson或Spearman相关性分析,二元Logistic回归分析等对数据进行统计学分析。结果:1.研究期间连续入组符合脓毒症(sepsis 3.0)诊断标准的患者204例,排除不符合研究要求的患者,90例脓毒症患者纳入研究分析,其中54(60%)例未发生心功能障碍进入脓毒症组,36(40%)例发生心功能障碍进入SICD组。根据此研究排除标准随机筛选因脑卒中入住脑科院区EICU的非脓毒症非心衰患者20例作为对照。2.相比对照组,脓毒症组和SICD组患者均存在感染,PCT和WBC升高,APACHE II及SOFA评分更高,心率偏快,血压偏低,氧合指数偏低,乳酸和肾功能指标均偏高,ICU住院时间延长(P<0.05);相比对照组,脓毒症组和SICD组患者的Ang II、IL-1β和TNF-α血浆浓度明显升高(P<0.001)。3.脓毒症组和SICD组患者的感染病因分布、PCT、WBC、氧合指数、肾功能指标和ICU住院天数均无组间差异(P>0.05);相比脓毒症组,SICD组患者APACHE II及SOFA评分更高,血压更低,乳酸更高(P<0.001)。4.与脓毒症组相比,SICD组患者LVEF显著降低,BNP、c Tn I、CK-MB显著升,Ang II、IL-1β和TNF-α血浆浓度显著升高(P<0.001或P<0.05)。相关性分析显示Ang II与c Tn I、BNP和IL-1β均有一定程度的正相关(r_s=0.5198,P<0.001;r=0.579,P<0.001;r_s=0.562,P<0.001)。5.相比脓毒症组,SICD组患者28天病死率显著增高(P<0.05),APACHE II评分,BNP、Ang II和TNF-α血浆浓度,是否发生SICD均是脓毒症患者28天病死率的独立危险因素。小结:1.脓毒症患者Ang II水平显著高于非脓毒症患者。2.SICD患者的病情更重,ICU住院时间更长;SICD患者Ang II、IL-1β和TNF-α水平显著增高;脓毒症患者血浆Ang II水平与BNP和c Tn I、IL-1β水平呈一定程度的正相关。3.SICD患者28天病死率显著增高,APACHE II评分,BNP、Ang II和TNF-α血浆浓度,是否发生SICD均是脓毒症患者28天病死率的独立危险因素。第二部分脓毒症心功能障碍小鼠的血管紧张素II血浆水平变化目的:应用LPS腹腔注射的方法制备SICD小鼠模型,验证SICD小鼠Ang II的血浆水平变化。方法:对健康清洁级成年雄性C57BL/6N小鼠,采用LPS10mg/kg腹腔注射诱导SICD。在LPS腹腔注射后3小时、6小时对小鼠进行左心功能评估,记录LVEF和LVFS。接受等容量生理盐水腹腔注射的小鼠作为对照。在LPS或生理盐水注射后6小时复查心脏超声后给予小鼠安乐死,采血收集血浆用于检测c Tn I、TNF-α、IL-1β和Ang II浓度,取心脏组织制作石蜡切片进行HE染色观察心肌组织病理学改变并进行半定量评分。采用配对或独立样本t检验用于分析相关参数的变化或组间差异。结果:1.LPS 10mg/kg腹腔注射可以成功模拟脓毒症的临床表现,在LPS腹腔注射后3小时小鼠出现精神不振,少动和进食水减少,炸毛,对外界刺激反应减弱,呼吸、心率加快,寒战,眼睛流脓,腹泻等。2.LPS 10mg/kg腹腔注射3小时后小鼠LVEF及LVFS较LPS 0小时显著下降(P<0.0001),LPS 6小时LVEF及LVFS进一步下降。LPS组小鼠在LPS注射后3小时和LPS注射后6小时的LVEF及LVFS均显著低于对照组(P=0.001;P<0.0001)。3.SICD小鼠表现出明显的心肌损伤,血浆c Tn I和组织形态学损伤评分较对照组显著增高(P<0.0001)。4.SICD小鼠血浆Ang II、TNF-α和IL-1β较对照组均显著升高(P<0.0001)。小结:1.剂量为10mg/Kg的LPS腹腔注射可以成功制备SICD小鼠,SICD小鼠LVEF及LVFS显著下降和心肌损伤明显。2.SICD小鼠TNF-α、IL-1β和Ang II血浆水平显著升高。第三部分重组人血管紧张素转换酶2对脓毒症心功能障碍小鼠的血管紧张素血浆水平、炎症反应以及减轻心肌损伤和心功能的影响目的:采用腹腔注射的方法对SICD小鼠补充rh ACE2,观察rh ACE2对SICD小鼠心肌损伤和左室收缩功能以及血管紧张素水平的影响。方法:预实验阶段选用两组不同剂量(100ug/kg和200ug/kg)的rh ACE2对LPS诱导心功能障碍成功的Hepatocyte-specific genes小鼠进行干预,发现200ug/kg rh ACE2对SICD小鼠心功能有显著改善。正式实验阶段,选取C57BL/6N小鼠随机分为对照组、LPS组和LPS+rh ACE2组(每组6只),在LPS注射后3小时超声心脏评估完成后立即分别给予3组小鼠用生理盐水、生理盐水和200ug/kg rh ACE2干预。LPS注射后6小时完成超声检查并记录LVEF和LVFS后安乐处死小鼠取血浆及心肌组织。应用酶联免疫吸附的方法测定血浆c Tn I、Ang II、Ang 1-7、TNF-α和IL-1β浓度。心肌组织制作石蜡切片,进行HE染色观察组织形态学改变,并进行心肌损伤半定量评分。结果:1.预实验显示rh ACE2 200ug/kg可以改善SICD小鼠的脓毒症表现和心功能(P=0.002)。因此,选取rh ACE2 200ug/kg进行后续实验研究。2.与对照组小鼠相比,LPS组小鼠出现明显的脓毒症表现,LPS+rh ACE2组小鼠脓毒症表现较LPS组减轻。3.LPS组小鼠LVEF及LVFS较对照组显著下降(P<0.0001);而LPS+rh ACE2组小鼠LVEF及LVFS较LPS组显著改善(P=0.001)。4.LPS组小鼠血浆c Tn I较对照组显著增高(P=0.001),而LPS+rh ACE2组血浆c Tn I较LPS组明显减低(P=0.027);与对照组相比,LPS组小鼠心肌HE染色显示明显的组织形态学损伤,心肌损伤评分显著增加(P<0.0001),与LPS组相比,LPS+rh ACE2组小鼠心肌组织形态学损伤及心肌损伤评分明显改善(P=0.003)。5.LPS组小鼠血浆Ang II(P<0.0001)和Ang 1-7(P=0.001)较对照组均显著升高。LPS+rh ACE2组Ang II血浆水平较LPS组显著降低(P=0.001),LPS+rh ACE2组Ang 1-7血浆水平较LPS组进一步升高(P=0.007)。6.LPS组小鼠TNF-α和IL-1β血浆浓度较对照组显著增高(P<0.0001);LPS+rh ACE2组小鼠TNF-α(P=0.011)和IL-1β(P=0.038)血浆浓度较LPS组明显控制。小结:1.应用rh ACE2可以减轻SICD小鼠的心肌损伤,改善左心收缩功能。2.应用rh ACE2可以降低SICD小鼠的Ang II血浆水平,进一步提高Ang1-7血浆水平。3.应用rh ACE2可以降低SICD小鼠的TNF-α和IL-1β血浆水平。第四部分重组人血管紧张素转换酶2对脓毒症心功能障碍小鼠的心肌NLRP3炎性小体激活及相关炎症因子和心肌细胞焦亡的影响目的:使用rh ACE2对SICD小鼠模型进行干预,对小鼠心肌组织进行蛋白分子分析和组织病理学检查,观察rh ACE2对LPS诱导的心功能障碍小鼠心肌NLRP3炎性小体激活和细胞焦亡及促炎效应的影响,并探究其中可能的分子信号途径。方法:小鼠分组和干预与第三部分实验相同。血及心肌组织标本收集与保存方法与第三部分实验相同。应用ELISA方法检测血浆IL-1β和IL-18浓度;应用免疫印迹方法,检测心肌组织NLRP3蛋白表达水平和Caspase-1和GSDMD活化程度以及相关分子信号途径包括NF-κB,p38MAPK和AMPK-α1的激活情况;应用TUNEL染色方法,检测心肌细胞焦亡发生情况;采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较三组间各指标差异,组间两两比较采用Least significance difference(LSD)或Tamhane’s T2检验。采用Pearson相关性分析探讨心肌NLRP3蛋白表达水平与血浆Ang II浓度的相关性。结果:1.与对照组相比,LPS组心肌NLRP3蛋白表达、Caspase-1和GSDMD激活显著增高(P<0.0001);与LPS组相比,LPS+rh ACE2组心肌NLRP3蛋白表达(P=0.025)、Caspase-1(P=0.037)和GSDMD(P=0.006)激活明显受到抑制。2.与对照组相比,LPS组小鼠IL-1β和IL-18(两个依赖NLRP3炎性小体成熟的炎症因子)血浆水平显著增高(P<0.0001),而LPS+rh ACE2组小鼠IL-1β(P=0.038)和IL-18(P=0.011)血浆水平较LPS组显著下调。3.心肌组织切片TUNEL染色显示,LPS组小鼠心肌组织细胞焦亡比对照组显著增多(P<0.001);而LPS+rh ACE2组心肌组织细胞焦亡比LPS组明显控制(P=0.001)。4.相关性分析显示心肌NLRP3表达与血浆Ang II水平呈显著正相关(r=0.884,P<0.0001)。5.LPS组小鼠心肌组织内NF-κB,p38MAPK途径激活较对照组显著增强(P<0.0001),LPS+rh ACE2组小鼠心肌组织内NF-κB(P=0.033),p38MAPK(P=0.001)激活较LPS组显著抑制;与此相反,LPS组小鼠心肌组织内AMPK-α1途径激活较对照组显著减低(P<0.0001),而LPS+rh ACE2组小鼠心肌组织内AMPK-α1激活明显恢复(P=0.014)。小结:1.应用rh ACE2可以抑制SICD小鼠的心肌NLRP3炎性小体激活,降低NLRP3炎性小体相关炎症因子IL-1β和IL-18水平,降低心肌组织内细胞焦亡,而抑制NF-κB和p38 MAPK途径,增强AMPK-α1途径可能是其分子机制。2.NLRP3的心肌表达水平与Ang II的血浆浓度正相关,提示rh ACE2对NLRP3炎性小体激活的抑制效应,可能与其降低血清Ang II水平的作用相关。第五部分血管紧张素1-7受体阻断剂对重组人血管紧张素转换酶2在脓毒症心功能障碍小鼠中的心肌NLRP3表达的抑制效应和心脏保护作用的影响目的:应用Ang 1-7特异性Mas受体(Mas receptor,Mas R)阻断剂A779对接受rh ACE2治疗的SICD小鼠进行干预,观察A779对rh ACE2的SICD小鼠的心脏保护作用的影响,探究Ang 1-7血浆水平的变化是否参与了rh ACE2对SICD小鼠的心脏保护作用。方法:采用与第二、三部分相同的方法制备SICD小鼠模型。随机分为对照组、LPS组、LPS+rh ACE2组和LPS+rh ACE2+A779组(每组6只),LPS 3小时分别予生理盐水、生理盐水、rh ACE2及rh ACE2+A779干预。LPS 6小时行超声心动图检查后予安乐死,收集血浆及心肌组织。ELISA方法测定c Tn I血浆浓度,心肌组织石蜡切片进行HE和TUNEL染色,观察心肌损伤和心肌内细胞凋亡情况。应用免疫印迹方法测定心肌组织内NLRP3蛋白表达情况。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较三组间各指标差异,组间两两比较采用LSD(least significance difference,LSD)或Tamhane’s T2检验。结果1.LPS组小鼠LVEF及LVFS较对照组显著下降(P=0.003),LPS+rh ACE2组小鼠的LVEF和LVFS显著改善(P=0.016),而LPS+rh ACE2+A779组小鼠LVEF和LVFS较LPS+rh ACE2组明显变差(P=0.028)。2.LPS组小鼠的血浆c Tn I较对照组显著增高(P=0.002),心肌损伤评分较对照组显著严重(P<0.0001),LPS+rh ACE2组小鼠的血浆c Tn I(P=0.033)和心肌损伤评分(P=0.008)较LPS组显著改善,而LPS+rh ACE2+A779组小鼠的血浆c Tn I(P=0.04)和心肌组织形态学损伤以及损伤评分(P=0.015)较LPS+rh ACE2组明显恶化。3.LPS组小鼠心肌细胞焦亡较对照组显著增加(P<0.0001),LPS+rh-ACE2组小鼠心肌细胞焦亡较LPS组显著减少(P=0.021),而LPS+rh-ACE2+A779组小鼠心肌细胞焦亡较LPS+rh ACE2组小鼠显著增加(P=0.031)。4.LPS组小鼠心肌NLRP3表达较对照组显著增加(P<0.0001),LPS+rh ACE2组小鼠心肌NLRP3表达较LPS组小鼠显著下降(P=0.03),而LPS+rh ACE2+A779组小鼠的心肌NLRP3表达较LPS+rh ACE2组显著增加(P=0.04)。小结:Ang 1-7特异性Mas R阻断剂A779不仅可以减弱rh ACE2对SICD小鼠的NLRP3心肌表达和心肌细胞焦亡的抑制作用,还可以减弱rh ACE2对SICD小鼠的心肌损伤和心功能的改善作用,提示rh ACE2在SICD小鼠中的心脏保护作用可能与其增加Ang 1-7的效应有关。结论:1.SICD患者的c Tn I和BNP较脓毒症组显著增高,病情严重程度显著加重,ICU住院时间和28天死亡率显著增高;SICD患者Ang II、AIL-1β和TNF-α血浆浓度显著高于脓毒症无心功能障碍患者,并与脓毒症患者发生心功能障碍和28天病死率增加相关。2.予C57BL/6N小鼠LPS腹腔注射可以模拟临床脓毒症症并成功制备SICD模型。SICD小鼠LVEF和LVFS下降,心肌组织病理学显示心肌损伤,心肌损伤标志物升高,并且SICD小鼠炎症因子水平和血浆Ang II、Ang1-7水平均显著升高,与本研究第一部分在脓毒症患者中的观察结果一致。3.SICD小鼠心肌NLRP3炎性小体激活和心肌组织内细胞焦亡显著增加。应用rh ACE2可以降低SICD小鼠的炎症因子水平,减轻心肌损伤和心脏收缩功能障碍,其机制可能是通过抑制NF-κB和p38 MAPK途径,增强AMPK-α1途径,从而抑制了心肌NLRP3炎性小体激活和后续的炎症反应放大和心肌细胞焦亡,发挥了心脏保护作用。4.应用rh ACE2显著降低了SICD小鼠的Ang II血浆水平。相关性分析显示心肌NLRP3蛋白表达水平与血浆Ang II水平具有一定程度的正相关,提示rh ACE2对SICD小鼠心肌NLRP3抑制效应与其降低Ang II水平的效应有关。5.A779,Ang 1-7特异性Mas R阻断剂,不仅可以减弱rh ACE2对NLRP3心肌表达和细胞焦亡的抑制作用,还可以削弱rh ACE2对SICD小鼠的心肌损伤和收缩功能障碍的改善作用,提示rh ACE2在SICD中的心脏保护作用与其增加Ang 1-7的效应有关。因此,rh ACE2治疗可以降低SICD的血浆Ang II水平,升高血浆Ang1-7水平,通过对NF-κB、p38 MAPK信号途径的抑制和对AMPK-α1信号途径的增强,可以抑制心肌组织NLRP3炎性小体激活,具有抑制炎症反应和心肌细胞焦亡,改善心肌损伤和心脏收缩功能的作用。

近年来,声称自己皮肤敏感的人群比例越来越高,主要表现为皮肤刺痛感、灼热感、痒感,这些症状的生理机制与皮肤屏障受损、皮肤神经感受异常、皮肤炎症有关。诱发敏感肌的因素很多,例如年龄、内分泌、气候、化妆品成分等等。其中,最常与皮肤接触的化学物质——表面活性剂对皮肤的刺激作用受到广泛关注和证实。因此,开发温和不刺激的表面活性剂原料是一种缓解敏感肌问题的解决方案。非致病酵母菌代谢得到的槐糖脂(SL)具有绿色温和、表面活性良好、独特生物活性等特质,可作为缓解敏感肌的一种天然原料,在个人护理及清洁领域具有很大潜力。然而,槐糖脂在国内大规模工业生产应用的实例很少,已被报道的提纯工艺较为复杂繁琐;关于槐糖脂生物活性的研究支撑数据相当少,需要进一步的机理探究。因此,本文研究了槐糖脂的提纯工艺优化及其针对敏感肌的抗炎舒缓功效,具体研究内容与结论如下:1.采用水洗法提纯发酵得到的SL,经过单因素筛选、正交优化后的水洗法提纯工艺为45℃下,p H为4,洗涤水添加量为1倍产物体积,水洗次数为3次。在此最优组合条件下,发酵液的蛋白脱除率为55.37%,糖脂损失率为9.90%。通过液质联用分析产物的组成结构,结果显示自制SL中酸型和内酯型的构型比例约为24:76,其中分子量为688的双乙酰化内酯型SL为产物的最主要成分。体外玉米醇溶蛋白实验及血红细胞溶血测试显示自制SL的超温和性,几selleck IDN-6556乎不与蛋白及细胞膜发生反应;透明质酸酶抑制实验的结果表明SL具备抗炎舒敏的潜力。2.建立LPS诱导的小鼠巨噬细胞体外炎症模型,在MTT细胞活力测试基础上,探究了SL抗炎的生物活性。结果显示SL能够显著减selleck PS-341少LPS诱导的炎症因子NO、IL-6、TNF-α的过度分泌,下调细胞内ROS、钙离子水平,降低i NOS、COX-2 m RNA的过度表达。同时,不同浓度的SL单独刺激细胞不会诱导细胞分泌额外的促炎因子,说明SL具有良好的抗炎活性。3.为了解释SL抗炎活性的具体机制,考察了SL对炎症反应中的关键转录因子之一NF-κB的调控作用。细胞免疫荧光染色实验的结果显示SL预处理可明显抑制LPS诱导的NF-κB核转录。此外,采用Western blotting法检测了SL对转录过程中p65和IκBα蛋白表达及磷酸化比例,结果显示不同浓度的SL预处理均能够抑制炎症引起的p65和IκBα的磷酸化过表达,降低磷酸化比例,说明在LPS诱导的体外炎症模型中,SL可以抑制炎症相关NF-κB通路的激活。分子对接辅助预测的结果表明,SL的作用靶点可能是Toll样受体复合物以及膜内激酶,从而阻止炎症信号的进一步传递。4.建立组胺诱导的体内小鼠瘙痒模型及体外角质细胞钙内流模型,在MTT细胞活力测试基础上,探究了SL舒缓皮肤瘙痒的生物活性。皮肤瘙痒刺激物组胺能够诱发小鼠的抓挠行为,行为学结果显示,SL对组胺引起的小鼠抓挠行为有抑制作用。小鼠抓挠部位皮肤的H&E染色图显示SL可以缓解皮肤瘙痒加剧后的屏障受损及炎症。利用荧光酶标仪、荧光显微镜,考察了SL对组胺诱导的Ha Ca T细胞钙内流的影响,结果表明不同浓度的SL预处理后,组胺诱导的钙内流被显著抑制。5.为了研究SL舒缓瘙痒的分子机制,首先利用钙的荧光标记,考察了在组胺刺激时SL与组胺H1或H4受体之间是否存在相互作用,结果表明SL可以通过与组胺H1、H4受体发生作用,抑制下游信号传导。此外,RT-PCR的结果显示,不同浓度的SL能够分别显著抑制组胺受体激活导致的PLCγ1、IP3R、PKCα信号分子基因的过度表达。为了进一步探讨SL抑制钙内Genetic compensation流的机制,研究了SL是否可以调控下游阳离子通道TRPV1的激活,结果显示SL能够下调TRPV1激活剂辣椒素诱导的钙内流。免疫荧光标记结果表明SL能够抑制辣椒素或组胺导致的TRPV1过度荧光表达,具有调节TRPV1通道活性的能力,分子对接预测结果表明SL可能通过相互作用的方式抑制刺激物激活TRPV1。

橄榄油加工生产过程中,会产生大量的橄榄磨废水(Olive Mill Wastewater,OMW),开展OMW的有效处理,开发符合国情的环境废水处理技术尤为迫切。OMW中存在高浓度的酚类化合物(Polyphenol Compounds,PCs)从而引发了一系列的环境污染问题,直接影响人类的健康。PCs已被证明具有多种药理活性和生物活性。然而,传统污水处理技术难以实现OMW中PCs的有效分离,导致高浓度PCs伴随OMW的排放而大量流失,造成极大的环境污染和资源浪费。因此,研究一种高效处理OMW中单一PCs的选择性分离方法具有重要意义。近年来,分子印迹膜(Molecularly Imprinted Membranes,MIMs)在选择性分离、提取、富集和纯化等领域展现出独特的优势。然而,传统的MIMs由于特异性识别位点少,选择性差等缺点无法满足对高浓度PCs的有效分离。因此,开发具有高选择性、高渗透性、优异水相识别能力的MIMs,用于OMW中单一PCs的高效分离具有重要意义和研究价值。本论文针对OMW中选择性辨识和分离高浓度PCs的严峻科学问题,使用了共价/非共价组装策略、单宁酸调控策略、光/热驱动环境响应策略等制备理念,成功获得壳聚糖基分子印迹膜,实现了选择性分离OMW中三种代表性PCs(木犀草素、山奈酚、槲皮素)的体系构建。所制备的壳聚糖基分子印迹膜提升了MIMs的选择性、渗透性、抗污性和稳定性,有效解决了复杂环境中单一PCs的辨识/分离难度大等问题,深入探究了MIMs的特异性识别机理。本论文为开发高选择性的功能型MIMs用于选择性分离PCs提供了研究思路和实验基础。论文的主要研究内容如下:(1)基于共价/非共价组装策略构建高性能MIMs及其选择性分离木犀草素的行为机理研究a.以提升吸附容量和mathematical biology选择性为出发点,将绿茶中提取的锰粒子(Mn NPs)均匀共混在聚丙烯腈(PAN)溶液中,利用静电纺丝法制备纳米纤维膜。将壳聚糖(CS)包裹在纳米纤维膜表面形成水化层,提高抗污性和拉伸强度。以木犀草素(LTL)为模板分子、4-氨基苯硼酸(4-APBA)和苯基三乙氧基硅烷(PTEOS)为双功能单体、四甲氧基硅烷(TMOS)为交联剂,成功制备LTL纳米纤维印迹膜(E-LMIMs)。通过等温吸附、动力学吸附、选择性渗透和动态分离等研究了E-LMIMs的吸附、分离性能,具有优异的选择性系数(3.55和4.20)、分离因子(4.04)和渗透选择性系数(4.41和5.41),最终获得兼具高选择性和高吸附容量的E-LMIMs。通过分子动力学模拟和原位红外光谱深入探讨特异性辨识和分离机理。Mn NPs表面的-OH和-COOH对LTL具有诱导作用,可在印迹预聚合过程中对LTL有效锚定,增加了印迹位点的合成效率;特异性辨识位点与LTL的空间效应以及共价/非共价相互作用进一步提高了E-LMIMs的选择性分离性能。锰粒子诱导策略构建的E-LMIMs有望成为处理OMW的有效途径。b.以构建高匹配度印迹位点及进一步提升选择性为出发点,通过双层表面印迹策略成功构建LTL复合印迹膜(MPL@CSMIMs)用于选择性分离LTL的性能研究。首先,利用聚多巴胺(PDA)作为功能单体和分子连接剂,在CS膜表面构建第一层印迹识别位点。其次,通过原子转移自由基聚合(ATRP)在引入共价/非共价功能单体(苯硼酸和氨基官能团)成功构建第二层印迹识别位点。考察了MPL@CSMIMs的等温吸附和动力学吸附、渗透选择性和稳定性。结果表明,MPL@CSMI此网站Ms具有优异的吸附容量(49.63 mg g~(-1))和选择性渗透性能(β_(AGN/LTL)=5.80,β_(CTC/LTL)=12.82),实现了对混合体系中的LTL的选择性辨识和分离。同时,通过原位红外光谱、分子动力学模拟以及X射线光电子能谱(XPS)深入探究了分子印迹识别位点的选择性分离机理。通过双层表面印迹策略构建的MPL@CSMIMs具有更加稳定、精确的印迹识别位点,并提升了与目标物的匹配度,从而提高选择性辨识和分离性能。(2)基于单宁酸调控策略构建高密度印迹位点MIMs及其选择性分离山奈酚的行为机理研究a.以膜孔结构中构建高密度位点提升选择性为出发点,利用深共熔溶剂(DES)与CS分子链之间的非共价相互作用(氢键)有效调控膜孔结构,成功制备具有互穿网络结构的多孔CS膜。随后,利用单宁酸(TA)和3-氨基丙基乙氧基硅烷(ATPES)的自聚合特性,通过原位生长策略在CS膜表面及微孔道中构建特异性识别位点,成功制备山奈酚(KMF)整体印迹膜(E-KMIMs)。同时,制备仅在膜表面形成印迹位点的MIMs(S-KMIMs)作为对比项,对其等温吸附、动力学吸附以及渗透性能进行探究。相比于S-KMIMs(α_(KMF/AGN)=2.38和α_(KMF/QRE)=2.47),E-KMIMs兼具较高选择性吸附(α_(KMF/AGN)=3.48和α_(KMF/QRE)=3.51)和选择性渗透性能(β_(AGN/KMF)=4.14和β_(QRE/KMF)=2.78),实现了混合体系中KMF的选择性辨识和分离。此外,利用分子动力学模拟和原位红外光谱证明了KMF与特异性识别位点的非共价相互作用,详细分析了选择性分离机理。基于原位生长策略构建的壳聚糖基整体印迹膜大大简化了MIMs的制备流程,提高了选择性位点的利用率。本项工作为设计和开发简单、高效的分子印迹分离膜提供了可行性策略。b.以调控膜孔结构提升渗透选择性为出发点,设计并制备二维(2D)层状纳米片组装分离膜。通过剥离技术,在具有化学惰性和抗污性能的六方氮化硼纳米片(h-BN)中间插入绿色表面活性剂(TA),从而减弱层间相互作用,成功获得TA功能化的h-BN纳米片(f-BN)。随后,通过真空抽滤将f-BN固定在CS膜表面,获得良好的亲水化学环境,在形成层状分离通道的同时,为后续印迹位点的合成提供了充足的生长空间。以KMF为模板分子,两种不同离子液体为功能单体和交联剂,通过自由基聚合成功制备KMF混合基质印迹膜(KMIMs)。通过等温吸附、动力学吸附、动态过滤及选择性渗透等实验研究了KMIMs的选择性分离性能。结果表明,KMIMs展现出高选择性分离因子(α_(KMF/AGN)=3.99和α_(KMF/QREPLX4032采购)=3.32)和选择性渗透因子(β_(AGN/KMF)=6.65和β_(QRE/KMF)=4.63),实现了KMF的选择性辨识和分离。利用紫外吸收光谱以及原位红外光谱证明了KMIMs的选择性分离机理。本工作为2D分离膜中构建精确选择性位点、优化化学微环境、实现特异性分离提供了新思路。(3)基于光/热驱动协同印迹策略构建环境响应型MIMs及其选择性分离槲皮素的行为机理研究a.以高效调控目标分子捕获/释放为出发点,制备光驱动快速响应型MIMs。首先,通过正硅酸乙酯(TEOS)为硅烷前驱体,在酸性条件下水解为硅羟基发生缩聚反应获得CS/TEOS混合物,降低膜材料的溶胀度。利用致孔剂的协同作用制备具有大孔结构的有机-无机杂化膜。以槲皮素(QRE)为模板分子、4-甲基丙烯酰氧偶氮苯(MAA)为光响应型功能单体、丙烯酰胺(AM)为协同单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)为交联剂、偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂,合成光驱动响应型有机-无机杂化印迹膜(P-QMIMs)。通过可见光/紫外光交替照射,探究了P-QMIMs的光响应性能。结果表明,所制备的P-QMIMs在可见光(440 nm)和紫外光(365 nm)的交替照射下发生反式-顺式异构化可逆反应,调控对模板分子的捕获和释放。通过等温吸附、动力学吸附、渗透实验探究了P-QMIMs的选择性分离性能。实验表明,P-QMIMs兼具高选择性吸附(α_(QRE/AGN)=3.18和α_(QRE/AGN)=3.32)和选择性渗透性能(β_(AGN/QRE)=3.68和β_(KMF/QRE)=2.52),实现了QRE的选择性辨识和分离。利用XPS和原位红外光谱解释了特异性识别机理,并获得选择性传质机理。本工作为设计和开发“智能型”MIMs开拓了新思路。b.以简化再生过程,提升抗污性为出发点,采用N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)为温度响应骨架单体和抗污聚合物链,制备热驱动响应型MIMs。首先,通过优化和调控TEOS的缩聚时间和致孔剂分子量制备有机-无机杂化膜(CS@TEOS),获得更适配的膜孔径大小,为平衡MIMs的渗透通量和渗透选择性提供了保障。以QRE为模板分子、NIPAM为温度响应单体、3-(丙烯酰胺)苯基硼酸(3-AAPBA)为共价功能单体、N,N′-亚甲基二丙烯酰胺为亲水交联剂,通过ATRP法成功制备热驱动响应型QRE自清洁印迹膜(T-QMIMs)。在不同温度下进行吸附实验探究了T-QMIMs的温度响应性能。实验表明,PNIPAM链在低于或高于临界温度(32~oC)时会产生构象转变,并产生亲/疏水性变化,对QRE实现有效吸附/解吸的同时,有效调控了T-QMIMs的再生性能,以达到自清洁的效果。通过吸附、渗透实验探究T-QMIMs的选择性分离性能。结果表明,T-QMIMs具有出优异的选择性分离因子(α_(QRE/AGN)=4.45和α_(QRE/AGN)=3.95)和高选择性渗透性能(β_(AGN/QRE)=3.62和β_(KMF/QRE)=3.04),实现了对QRE的选择性辨识和分离。通过XPS、原位红外光谱,深入探究T-QMIMs的特异性识别和分离机理。本实验为设计和开发具有高选择性的环境响应型自清洁MIMs提供了坚实的理论和实践基础。

毛樱桃(Prunus tomentosa Thunb.)为我国特有的落叶果树,隶属蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)樱亚属(subg.Cerasus)矮生樱桃组(section Microcerasus),其自然分布广泛,生态型丰富。毛樱桃自交亲和力强、果梗极短、抗裂果能力强、抗寒性及土壤适应能力突出,是杂交育种的优良亲本材料。目前,关于毛樱桃的遗传多样性分析不够全面,谱系地理结构及种群历史动态的研究仍未见报道。因此,本研究广获悉更多泛收集了西北新疆至东北吉林的15个省或自治区毛樱桃种质,在此基础上,利用双亲遗传的核SSR(Nuclear Simple Sequence Repeats,nSSR)和核糖体内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer,ITS)及母系遗传的叶绿体DNA序列(Chloroplast DNA,cpDNA)3个分子标记方法全面分析了毛樱桃种群的遗传多样性、种群地理结构及历史动态,并基于叶绿体基因组学探索了毛樱桃的叶绿体基因进化特性及其在李属的分类地位。主要研究结果:(1)利用nSSR分子标记对采自15个省份的40个毛樱桃居群822个生态型进行遗传多样性和种群结构分析,发现毛樱桃种群具有丰富的遗传多样性,且存在明显的种群分化现象。10个nSSR引物共检测到平均可观测等位基因12个、平均有效等位基因6.1个,且遗传多样性指标可观测杂合度(Ho=0.546)、期望杂合度(He=0.819)、香农信息指数(I=1.951)、多态性信息含量(PIC=0.799)、多态位点比率(PPL=96%)均较高,说明我国发现毛樱桃种群具有较高的遗传多样性水平,其中甘肃小陇山(Gan-Xl M)、秦岭(Shaan-LT、Gan-Zh C)、华山(Shaan-HM)及子午岭(Shaan-Xf D)的毛樱桃居群遗传多样性最丰富。同时发现我国毛樱桃种群存在着较高的遗传分化现象:基于杂合子的Fst值为0.152,基于方差分析的Fst值为0.196,基因流动水平(Nm=1.065)较稳定,且发现毛樱桃居群间的遗传距离和地理距离存在显著的相关性(R~2=0.065,P<0.05)。并通过聚类分析、结构分析及主成分分析可将40个居群划分为西北和东北华北两大集群,而Chuan-Aba、Xin-TKS与Xin-ALR居群明显和这两大集群分离,其次为Ning-Hl M、Gan-PL、Hebei-Ch L＿I和Meng-BT四个居群。(2)基于相对保守且存在较多变异的3个叶绿体基因间隔区(rps16-trn Q、pet N-psb M和rps4-trn T-trn L)和1个核核糖体ITS基因间隔区(ITS1-ITS4)对毛樱桃42个居群779个生态型谱系地理结构进行了分析。获得cpDNA比对拼接序列文件2,485 bp,ITS比对序列615 bp,分别检测到36和57个单倍型,且均具有丰富的单倍型多样性,ITS单倍型多样性(Hd=0.877、Ht=0.921)高于叶绿体单倍型(Hd=0.689、Ht=0.781),Gan-Xl M居群的叶绿体单倍型种类最多(10个),Liao-QM的ITS单倍型种类最多(15个)。同时,基于遗传分化系数Nst和Gst推断我国毛樱桃种群呈现谱系地理结构,基于ITS推断毛樱桃种群分布呈现显著的地理结构(Nst=0.337>Gst=0.193,P<0.01)。根据单倍型地理结构及聚类分析可将我国毛樱桃分为两大谱系群,一个是以东北和华北为主的东部谱系群,另一个是以西北为主的西部谱系群(包含四川、河南和山西5个种群)。Mantel检验也证明了毛樱桃居群间遗传距离与地理距离在cpDNA(R~2=0.0402,P=0.0052<0.01)和ITS(R~2=0.2458,P=0.0001<0.001)水平上均存在显著的相关性。但cpDNA和ITS水平遗传变异分析结果存在较大的差异,基于cpDNA发现毛樱桃群体遗传变异主要发生于居群间(Fst=0.6077),而基于ITS则发现遗传遗传变异居群内高于居群间(Fst=0.3447)。此外,基于ITS的基因流(0.475)远高于叶绿体水平的(Nm=0.161),这与核的双亲遗传、叶绿体的母系遗传特性以及种子和花粉传播的速率有关。因此,我国毛樱桃种群具有丰富的单倍型多样性,且存在谱系地理结构。(3)我国毛樱桃在历史进化过程中经历了重组事件,并发生了种群扩张现象。基于cpDNA和ITS数据,通过“四配子检测法”推断我国毛樱桃在历史进化过程中最小重组事件发生数分别为3和6。且根据失配分布图呈现单峰或不明显的双峰,推断毛樱桃在历史进化过程中经历了种群突然扩张的现象,基于叶绿体数据推断扩张时间约发生在4.59 ka BP,同时推断毛樱桃共同祖先大约出现在中新世中期,东Bucladesine使用方法西两大谱系分化时间大约发生在12.31 Ma,这可能与中新世喜马拉雅山的抬升、北极冰盖等历史事件相关,两大谱系进一步分化的时间发生在上新世至全新世(0.13～7.17 Ma)。同时根据祖先分布区重建,推测毛樱桃物种可能起源于东北地区。(4)基于叶绿体全基因组序列比较分析,发现毛樱桃叶绿体基因组存在着遗传变异现象。尽管叶绿体基因组相对保守,但是通过源自吉林、陕西太白、四川阿坝、新疆阿拉尔4个毛樱桃样品进行叶绿体基因组组装,发现毛樱桃的叶绿体基因组呈现典型的四段式环状结构,但基因大小有所不同,分别为157,517 bp、157,571 bp、157,999 bp和158,065 bp,存在遗传变异现象。通过与其它10个樱亚属物种比较分析,发现毛樱桃在进化过程中叶绿体编码基因rps15、rps19、mat K和ccs A趋于宽松选择模式,后两个存在正向选择的可能性;atp A、rps3、cem A、psb B、rpo A、ndh K、pet B和rpo C1表现为很明显的纯化选择模式(Ka/Ks<<0.5)。此外,采用贝叶斯推断法和最大拟然法,基于叶绿体全基因组、大单拷贝区、小单拷贝Western Blotting Equipment区、反向重复区、编码蛋白区、基因间隔区6个数据集,重建了毛樱桃与其它李属物种的系统发育树,发现毛樱桃与长梗扁桃、榆叶梅及郁李(本研究所用材料)的亲缘关系最近。

世界卫生组织报告了发展中国家普通人群中皮Elexacaftor核磁肤真菌病的患病率高达19.7%,其中Trichophyton rubrum(T.rubrum)是导致皮肤癣病的主要病原菌,对指甲、皮肤和毛发中的角化结构具有高亲和力,并且传染快,难治愈,导致人类真菌感染率日益增加。T.rubrum所致的皮肤癣病反复发作,而现有治疗皮肤癣病的药物大多具有抗菌谱窄,肝肾毒性较大,且易产生耐药性等问题。本文筛选分离了一株可抑制T.rubrum的菌株,经鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌,命名为HY-1。进一步的对其发酵产物进行分离纯化,获得一种脂肽类物质命名为LP-1,其可以通过破坏细胞膜通透性阻碍麦角甾醇的生物合成的方式抑制T.rubrum的生长。当前国内外尚无相关解淀粉芽孢杆菌抗T.rubrum活性及机制的报道。因此,本论文旨在研究解淀粉芽孢杆菌对T.rubrum的拮抗作用及机制研究,为开发新的抗真菌药物提供理论和实验依据。研究目的:本论文旨在从解淀粉芽孢杆菌的发酵液中分离出一种具有对T.rubrum拮抗活性作用的抗菌物质,并探究其对浅部真菌T.rubrum的抑制作用及机制。研究方法:(1)针对分离的目标菌种进行分离纯化和镜检,并采用革兰氏染色、生理生化特性分析以及16S r DNA序列比对等方法鉴定菌株菌属。(2)针对HY-1发酵液抗T.rubrum的特性进行研究,探究温度、p H等因素对其抗真菌作用。(3)采用盐酸沉淀法、有机溶剂提取发酵液中的抗菌物质,通过大孔吸附树脂纯化抗菌物质,应用薄层色谱、排油圈实验、紫外光谱、红外光谱定性分析该抗菌物质。(4)通过显微镜观察解淀粉芽孢杆菌对T.rubrum孢子萌发及菌丝生长的作用,根据用药前后电导率变化及核酸渗漏结果,分析细胞膜通透性的变化,并进一步研究解淀粉芽孢杆菌抗菌物质对麦角甾醇合成的影响。研究结果:(1)结果发现HY-1在T.rubrum平板中具有明显的拮抗作用,镜检结果显示HY-1为杆状,属革兰氏阳性、可产芽孢,并结合生理生化特性鉴定与16S r DNA分子学鉴定确定HY-1为解淀粉芽孢杆菌。(2)解淀粉芽孢杆菌发酵上清液对T.rubrum具有抗菌活性,并且对T.rubrum的抗菌作用对温度,p H等因素稳定。(3)实验发现分离纯化的抗菌物质Rf=0.67,命名为LP-1紫外光谱和红外光谱结果表明其具备脂肽的特征吸收峰和特征基团,并结合排油圈活性实验鉴定解淀粉芽孢杆菌产生的抗菌物质属于脂肽类。(4)LP-1可以抑制T.rubrum的孢子萌发,作用T.rubrum后菌丝出现萎缩,表面粗糙,菌丝顶端膨大和局部变形,且菌丝生物合成受到抑制。在LP-1存在的情况下,T.rubrum核酸被逐步释放,并且电导率呈剂量依赖性升高,进一SAHA步的T.rubrum细胞膜麦角甾醇合成量也被抑制,T.rubrum细胞膜的完整性在暴露于LP-Immunohistochemistry Kits1后受到损害,细胞膜通透性发生改变。研究结论:实验室分离了一株具有抗T.rubrum活性菌株经鉴定为解淀粉芽孢杆菌,命名为HY-1。对该菌株的发酵液经过分离纯化得到抗菌物质为脂肽,命名为LP-1,其对皮肤癣菌具有显著的抗菌活性,本文研究证明了LP-1可与T.rubrum细胞膜相互作用并破坏细胞膜的完整性,导致核酸泄漏,并且LP-1呈剂量依赖性使处理过的T.rubrum细胞中麦角固醇含量降低,本文的研究支持了LP-1作为抗真菌剂对抗T.rubrum的潜在用途。

革兰氏阴性溶杆菌属于γ-变形菌纲黄单胞科,对多种植物病原真菌、细菌、卵虫和线虫均具有显著拮抗活性,是一类新型植物病害生防细菌。溶杆菌能够代谢产生多种结构类型复杂、活性显著的天然产物,是发现活性天然产物的新资源。其中,产酶溶杆菌C3具有显著的抗植物致病真菌和线虫病害活性,通过开展其抗真菌成分的生物合成机制研究,有望通过合成生物学手段进一步提升菌株的抗真菌防效。与此同时,通过完善产酶溶杆菌C3的遗传操作体系,引入外源抗细菌生防物质,系统挖掘本源活性成分,有望拓展并提升其生防效力,从而推动溶杆菌生防菌剂的开发与利用。基于上述研究背景,本论文开展了产酶溶杆菌C3抗真菌化合物HSAF和其同家族成员pseudoamides的多环体系合成机制研究,以及菌株C3的生防效力改良和活性产物挖掘。1.HSAF多环体系合成机制MDV3100体内实验剂量:通过同位素标记实验和标记产物的分离鉴定,揭示了醇脱氢酶OX4通过延长的1,6迈克尔加成反应合成HSAF内侧6元环,明确了OXMC3临床试验4催化反应的底物区域选择性和立体选择性。通过对HSAF基因簇进行黄素依赖性氧化还原酶基因的组合生物合成改造,首次在体内证明OX1和OX2可能通过环化-羟基化偶联反应合成HSAF内侧5元环。通过在大肠杆菌BAP1中共表达负责多烯前体合成的PKS/NRPS合酶CbmA和负责5/5双环形成的OX1、OX2、OX3,明确了大肠杆菌可合Proteomics Tools成活性OX重组蛋白。2.Pseudoamides 5/5双环合成机制:通过体内组合生物合成、体外生化和同位素标记实验,阐明了负责pseudoamides 5/5双环合成的黄素依赖性氧化还原酶Pel1和Pel3的催化机制。Pel1和Pel3的催化功能均依赖还原伴侣进行电子传递。其中,Pel1通过还原性[2+3]环加成反应合成外侧5元环,引入的两个氢分别来自FMNH2和H2O;Pel3可能依赖FMN-C4a-hydroxyperoxide实现环化-羟基化偶联反应合成内侧5元环,羟基氧来源于O2。3.产酶溶杆菌C3的生防效力改良和活性产物发现:(1)通过筛选活性启动子、建立位点特异性整合系统和CRISPR-Cpf1基因编辑系统,逐步完善了产酶溶杆菌C3的分子遗传操作体系。(2)利用活性启动子和位点特异性整合系统成功实现了抗生素溶杆菌ATCC 29479来源的吩嗪生物合成基因簇在菌株C3的异源表达,获得了细菌拮抗活性显著提升的工程菌C3-cophz和C3-phz。(3)利用同源重组策略构建了C3主产物连续敲除突变株C3ΔHWL。利用生物活性追踪分离法,首次从溶杆菌中分离鉴定了具有抗细菌和抗真菌活性的已知化合物吡咯-2-羧酸。综上所述,本论文通过体内外研究解析了 5/5/6三环HSAF和5/5双环pseudoamides的多环体系合成机制,部分解答PoTeMs多环体系合成的共性问题,不仅为HSAF类化合物的组分简化和活性改良奠定了基础,而且为后续PoTeMs的多环体系改造提供了新催化元件和理论依据。此外,通过完善产酶溶杆菌C3的遗传操作体系,引入外源抗细菌吩嗪类化合物,显著提升了产酶溶杆菌C3的生防效力,为其开发为优良生防菌剂奠定了基础。

目的:二联大剂量与含铋剂四联方案根除幽门螺杆菌的疗效观察。方法:选择2022年1月至2022年10月就诊于山西医科大学第一医院消化内科门诊的H.pylori阳性的初治患者177例。随机分为三组,伏诺拉生二联组(VPZ-HDDT组)58例:伏诺拉生20mg/次,2次/d、阿莫西林750mg/次,3次/d,治疗14d;PPI组(PPI-HDDT组)62例:艾司奥美拉唑40mg/次,2次/d、阿莫西林750mg/次,3次/d,治疗14d;铋剂四联组(BQT组):艾司奥美拉唑40mg/次,1次/d、阿莫西林1000mg/次,2次/d、呋喃唑酮100mGNE-140 molecular weightg/次,2次/d、胶体果胶铋150mg/次,3次/d,治疗14d。治疗结束停药至少4周后复查~(13)C或~(14)C呼气试验。治疗第7天和第14天进行电话或门诊随访,详细记录患者的服药情况和不良反应。采用遵循研究方案(PP)分析和意向性治疗(ITT)分析两种方法比较3组间H.pylori根除率。采用卡方检验、t检验、单因素方差分析进行统计学分析。结果:VPZ-HDDT组、PPI-HDDT组、mTOR抑制剂BQT组的PP分析根除率分别为90.7%、89.3%、90.6%(P=0.961);ITT分析根除率分别为84.5%、80.6%、84.2%(P=0.719)。两种分析方法中,VPZ-HDDT组的根除率均高于PPI-HDDT组和BQT组,但差异均无统计学意义。VPZ-HDDT组、PPI-HDDT组、BQT组患者的依从性分别为93.1%、90.3%、92.9treacle ribosome biogenesis factor 1%,差异无统计学意义(P=0.815)。VPZ-HDDT组和PPI-HDDT组不良反应发生率明显低于BQT组(7.4%、5.3%、18.9%;P=0.046)。结论:二联大剂量与含铋剂四联方案根除H.pylori的疗效相当,且不良反应少,可作为H.pylori一线根除治疗的方案。含伏诺拉生方案有望成为H.pylori根除治疗的最佳选择。