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目的 探究促性腺激素释放激素类似物联合生长激素对性早熟Navitoclax女童性激素和骨代谢的影响。方法 选取2017年1月—2020年1月金华市中心医院收治的性早熟女童54例为研究对象，根据随机数字表法将其分为对照组(27例)和观察组(27例),对照组患儿给予促性腺激素释放激素类似物进行治疗，观察组患儿在其基础上加用生长激素。比较两组患儿治疗前后性激素水平、骨代谢相关指标水平、性发育相关指标水平及生长相关指标水平。结果 治疗前，对照组和观察组患儿卵泡刺激素(FSH)[(12.95±3.86)IU/L、(12.76±3.82)IU/L]、黄体生成素(LH)[(27.15±5.43)IU/L、(27.21±5.44)IU/L]及血清雌二醇(E_2)[(40.27±16.11)pmol/L、(40.55±16.23)pmol/L]水平比较，差异均无统计学意义(t=0.182、0.484及0.064,均P>0.05);治疗后6个月和12个月，两组患儿FSH、LH及E_2水平均显著低于治疗前，且观察组患儿FSH[治疗后6个月(3.41±1.72)IU/L、治疗后12个月(0.65±0.58)IU/L]、LH[治疗后6个月(5.25±1.07)IU/L、治疗后12个月(0.59±0.14)IU/L]及E_2水平[治疗后6个月(26.14±6.99)pmol/L、治疗后12个月(19.15±5.49)pmol/L]均显著低于对照组[治疗后6个月(4.53±2.27)IU/L、(7.27±1.65)IU/L及(30.52±17.83)pmol/L,治疗后12个月(1.04±0.75)IU/L、(1.01±0.21)IU/L及(23.47±6.51)pmol/L],差异均有统计学意义(治疗后6个月t=2.043、7.980及2.168,治疗后12个月t=2.137、8.647及2.636,均P<0.05)。治疗前，两组患儿Ⅰ型前胶原羧基端肽(PICP)、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、Ⅰ型胶原羧基端肽β特殊Growth media序列(β-CTX)及骨钙素N端中分子片段(N-MID)水平比较，差异均无统计学意义(均P>0.05);治疗后6个月，两组患儿PICP、IGF-1及N-MID水平比较，差异均无统计学意义(均P>0.05),观察组患儿β-CTX水平显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05);治疗后12个月，两组患儿PICP、N-MID水平比较，差异均无统计学意义(均P>0.05),观察组患儿IGF-1、β-CTX水平显著均高于对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。组内比较，对照组患儿治疗前后β-CTX和IGF-1水平比较，差异无统计学意义(P>0.05),PICP、N-MID水平显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.05);观察组患儿治疗前后IGF-1水平比较，差异无统计学意义(P>0.05),PICP、N-MIDLEE011 molecular weight水平显著降低，β-CTX水平显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)。治疗前，两组患儿Tanner分级、子宫体积及卵巢体积比较，差异均无统计学意义(均P>0.05);治疗后6个月和12个月，两组患儿Tanner分级、子宫体积及卵巢体积均显著低于治疗前，且观察组患儿Tanner分级、子宫体积及卵巢体积均显著低于对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。治疗前，两组患儿BA、 PAH及HtSDSBA比较，差异均无统计学意义(均P>0.05);治疗后6个月和12个月，两组患儿BA比较，差异无统计学意义(P>0.05),观察组患儿PAH显著高于对照组，HtSDSBA显著低于对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。组内比较，两组患儿治疗前后PAH、HtSDSBA均变化显著，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 促性腺激素释放激素类似物联合生长激素能有效降低性早熟女童性激素水平，改善其骨代谢指标，抑制患儿性发育，促进患儿生长，疗效较好。

目的：本文旨在探讨TRIM24调控巨噬细胞极化在小鼠病毒性心肌炎（VM）中的作用及初步分子机制。方法：建立柯萨奇病毒(CVB3)诱导的VM小鼠模型，检测心肌组织中TRIM24的表达。体内实验观察CL13900TRIM24抑制对VM小鼠心肌炎严重性及心脏浸润巨噬细胞极化表型的影响。建立小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）体外极化模型，观察TRIM24抑制在BMDMs向M1及M2极化中的作用，及其对BMDMs吞噬和杀菌功能的Immune check point and T cell survival影响。最后检测TRIM24抑制对STAT6总蛋白及磷酸化水平的影响。结果：TRIM24在VM小鼠心肌组织中显著高表达（P<0.001），抑制TRIM24能有效缓解VM，并促进心脏浸润巨噬细胞向M2极化。体外实验证实，TRIM24在BMDMs向selleck激酶抑制剂M2极化过程中显著下调（P<0.01），抑制TRIM24表达能促进巨噬细胞向M2极化并抑制其M1表型，同时伴随STAT6磷酸化水平显著升高（P<0.01）。结论：TRIM24抑制可通过激活STAT6信号通路调控巨噬细胞M2极化缓解VM。

在过去的几年中,诸如光热治疗(PTT)和光动力治疗(PDT)的光疗法在癌症治疗中得到了迅速发展。采用近红外荧光成像实时监控药物在肿瘤部位的积累与代谢,并在荧光成像的引导下进行近红外光激发,从而精确控制肿瘤部位的光治疗,是肿瘤治疗的重要手段。然而,对于成像引导的光治疗还存在许多问题:如有机探针的疏水性、靶向性差、信噪比低及较浅的组织穿透深度等。纳米材料由于其优异的特性,可将具有各种功能的化学分子结合,构建出多功能水溶性纳米探针,实现药物在体内的可CX-5461采购视化递送以及高效的光学治疗。氟硼二吡咯(BODIPY)衍生物是一类重要的有机染料,由于其独特的化学和物理特性以及丰富的结构修饰在生物成像和癌症治疗中得到了广泛的应用。在本论文中,通过在BODIPY骨架引入不同的修饰基团,一方面实现了更优异的荧光成像性能;另一方面,通过改变BODIPY分子的激发态弛豫路径,产生活性氧物质或者热量分别用于PDT和PTT。结合响应性的两亲聚多肽构建出的具有成像及光疗性能的智能纳米粒子在肿瘤成像及治疗中具有良好的应用。大多数荧光团的荧光成像都会受到指定区域以外的非特异性背景信号的干扰,而差的成像对比度会影响肿瘤治疗的准确性。在论文第二章中,我们通过在BODIPY骨架中位引入二甲氨基苯基,设计出酸性条件下可激活荧光及PDT功效的BODIPY染料(BDPI)。重原子碘的引入,使得BDPI的单线态氧(1O2)量子产率高达0.818。用pH敏感的两亲性聚多肽POEMA23-PE9包裹BDPI,获得双pH响应的智能纳米粒子(BDPINPs)。体内研究表明,BDPINPs在肿瘤酸性微环境中能够解体并释放出BDPI分子。BDPI在溶酶体(pH=4.0-5.5)中能够发生质子化,实现肿瘤内近红外荧光的“关-开”转换。同时促进1O2的产生,实现了对肿瘤的特异性和选择性成像及治疗。与近红外光(NIR,650-1700 nm)成像相比,近红外第LGX818体内二窗口(NIR-II,1000-1700nm)成像,可以实现更高的荧光成像对比度及更深的穿透深度。调整染料聚集方式被证明是实现吸收和发射光谱红移的有效策略。在第三章中,我们通过半乳糖分子修饰的BODIPY(Gal-BDP)利用分子间氢键(H-bond)和π-π相互作用成功在水中形成Gal-BDP的J-聚集体(J-NPs),J-NPs具有更长的吸收(λabs=815 nm)和发射(λem=1060 nm)波长。在808 nm激光下,J-NPs的光热转换效率(PCE)高达55%。此外,由于半乳糖对肝癌细胞的靶向作用,通过NIR-Ⅱ荧光在细胞水平上观察到肝癌细胞对颗粒更快的吸收。将J-NPs注入肿瘤后,实现NIR-Ⅱ荧光成像辅助的肝癌肿瘤的光热治疗。然而,Gal-BDP J-NPs的稳定性问题限制其进一步应用。同时,我们发现Gal-BDP的聚集方式可通过溶液的pH进行调控。所以,在第四章experimental autoimmune myocarditis中,我们分别用不同聚合物包裹Gal-BDP后形成了以H-聚集为主的P-ipr@Gal NPs和以J-聚集为主的PAsp@Gal NPs。在肿瘤酸性微环境下,由于聚合物载体P-ipr及染料分子Gal-BDP的酸响应性,P-ipr@Gal NPs实现了从H-聚集到J-聚集的转变。该过程明显增强了红移的吸收和荧光发射(λabs=830 nm,λem=1060 nm),同时伴随着PCE的提高,实现了小鼠酸性肿瘤区域特异性的NIR-Ⅱ成像及其引导的光热治疗。此外,PAsp@Gal纳米粒子具有良好的J-聚集特性,在肿瘤的NIR-Ⅱ荧光成像和PTT治疗(PCE=46%)方面具有很好的应用。对于PTT来说,通常需要将肿瘤组织温度升高到50℃以上,而如此高的温度可能会对正常的组织造成损伤。因此,相对低温的光热疗法(MPTT)受到越来越多的关注。在第五章中,我们将具有良好NIR-Ⅰ/Ⅱ荧光及光疗性能的探针Ahx-BDP和抗糖酵解试剂2-脱氧-D-葡萄糖(2DG)共同引入到两亲性聚多肽侧链中,制备了多功能的纳米粒子pDG@Ahx。该纳米粒子不仅可以实现NIR-Ⅱ荧光引导的不同激发波长(730 nm,808 nm)下的PDT/PTT协同治疗,而且可以在酸性条件2DG释放的情况下,增强肿瘤对温度的热敏性,达到饥饿/MPTT/PDT的协同疗效。活体实验表明,在730nm光照下,pDG@Ahx可以在温和光热条件下实现有效的肿瘤治疗。在整篇论文中,我们通过对BODIPY骨架和两亲性聚多肽载体的设计,制备出一系列具有优异成像和治疗性能的智能纳米体系,在肿瘤的实时可视化和原位诊疗方面具有很好的应用前景。

脓毒症(Sepsis)是一种由宿主对感染反应失调导致的危及生命的器官功能障碍综合症。脓毒症的过度炎症阶段发生的细胞因子风暴会导致多器官功能障碍甚至机体死亡。目前,开发脓毒症治疗药物仍面临巨大挑战。研究表明,喜树碱(Camptothecin,CPT)可以通过抑制拓扑异构酶I(Top1)的活性减轻炎症反应。但溶解性差、对非靶细胞的高毒性和体内活性低限制了CPT的临床应用。大量研究表明构建CPT前药是提高其治疗活性的有效策略之一。L型氨基酸的生物相容性较好,并且能够大大提高母体药物的溶解性,因此被广泛应用于前药的研究。十八烷二酸常用于药物的修饰,以改善药物的药代动力学特征,提高药物的治疗活性。因此,本研究将5种L型氨基酸(谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、丝氨酸和缬氨酸)及十八烷二酸与CPT偶联,构建了6种前药化合物——CPTL-7、CPTL-8、CPTL-9、CPTL-10、CPTL-13和CPTL-14,并从物理化学特性、体内和体外实验三个方面探究脂肪酸修饰的喜树碱-氨基酸前药的抗炎活性。在偶联氨基酸和十八烷二酸后,类似物的溶解度较CPT有一定提高。引入赖氨酸的CPTL-9和丝氨酸的CPTL-10的溶解度分别比CPT提高了4倍和7倍。MTT试验结果表明,所有类似物对小Imidazole ketone erastin鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW 264.7)的细胞毒性均低于CPT,其中引入谷氨酸的CPTL-7的毒性下降了8.4倍,CPTL-9下降了2倍。此外,类似物均能够有效抑制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激后RAW 264.7产生的一氧化氮(Nitric oxide,NO)。在对LPS刺激后的RAW264.7细胞内促炎细胞因子表达的检测中,CPTL-7和CPTL-9能够显著抑制IL-1β、IL-6和TNF-α的表达。最大耐受剂量实验(Maximum tolerated dose,MTD)的结果表明,除了CPT(MTD为12 mg/kg)和CPTL-10(MTD为16 mg/kg)具有较高的毒性外,其它类似物的MTD均高于32 mg/kg,这表明脂肪酸和氨基酸的共同修饰可以降低CPT的体内毒性。在LPS诱导的脓毒症小鼠模型中,CPTL-7和CPTL-9可以在1 mg/kg的剂量下显著提高脓毒症小鼠的存活率,而其他类似物并未表现出明显的治疗活性。另外,组织病理切片结果表明CPTL-7和CPTL-9可以明显降低LPS对小鼠组织器官的损伤。并且,酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay,ELISA)试验结果表明,CPTL-9可以显著降低血浆中IL-6和TNF-α的蛋白水平。在对给药剂量和给药频次进行优化后,虽然未达到预期的治疗效果,但CPTL-7和CPTL-9仍使脓毒症小鼠的存活率显著提高。总之,本研究发现脂肪酸和氨基酸的组合修饰可以显著降低CPT的体内毒性。尽管所有类似物都表现出一定的体外抗Eukaryotic probiotics炎活性,但只有CPTL-7和CPTL-9的体内抗炎活性较CPT有显著提高。这可能是不同的药代动力学特征影响了不同类似物的体内抗炎活性,这还需要进一步证明。尽管如此,较低的体内毒性www.selleck.cn/products/PD-0325901和较高的体内抗炎活性可以使CPTL-7和CPTL-9成为脓毒症治疗的潜在化合物。此外,本研究还为发展新型的脓毒症治疗药物提供了一种新的修饰策略。

目的 研究银翘清咽颗粒治疗小儿呼吸道合胞病毒(RSV)急性支气管炎的疗效与作用。方法 选取2021年1月～2021年12月广东省第二中医院儿科及发热门诊RSV急性支气管炎患者86例，随机数字生成器分为对照组与观察组，每组43例。对照组予盐酸丙卡特罗口服液与布洛芬对症治疗，观察组予银翘清咽颗粒治疗，两组均连续治疗5d。观察两组患儿治疗前后症状和体征，观察两组患者退热所需时间、咳嗽消失所需时间，采用中医证候评分进行总体疗效评价。酶联免疫法检测两组患儿治疗前后血清白介素(IL)-6、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)的含量。观察两组患者RSV转阴率与不良反应发pre-deformed material生情况。结果 观察组总有效率为95.35%,高于对照组的79.07%,差异有统计学意义(χ~2=5.11,P=0.02<0.05)。观察组显效率为72.09%,高于对照组的48.84%,差异有统计学意义(χ~2=4.86,P=0.03<0.05)。观察组治疗后中医证候评分低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。观察组退热所需时间与咳嗽消失所需时间均少于对照组，差异有统计学意义(P<www.selleck.cn/products/r-gne-1400.05)。观察组治疗后血清IL-6与MIF含量低于对照组selleck激酶抑制剂，差异有统计学意义(P<0.05)。观察组RSV转阴率为93.02%(40/43),高于对照组的65.12%(28/43),差异有统计学意义(χ~2=10.12,P=0.00<0.05)。两组患者治疗期间均未见不良反应发生。结论 银翘清咽颗粒可有效改善RSV感染急性支气管炎患儿的临床症状，其作用与抑制IL-6与MIF水平有关。

甘蓝型油菜是我国乃至全世界重要的油料作物之一,由野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.Campestris,Xcc)引起的黑腐病严重影响油菜作物的生产和发展,植物抗病和育种是控制病害的有效途径。紫黄质脱环氧化酶(Violaxanthin de-epoxidase,VDE)是叶黄素循环过程中关键性的酶,能影响ABA合成前体紫黄质的形成。而ABA作为重要植物激素,在抗病方面发挥着巨大功能,提示VDE参与抗病的可能性。油菜VDE含三个保守结构域,分别为N-末端富半胱氨酸结构域、脂质转运蛋白结构域和C-末端富谷氨酸结构域,具有两个同源拷贝,将其命名为BnaA06.VDE和BnaC05.VDE。本课题聚焦于油菜紫黄质脱环氧化酶VDE,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对BnaVDE进行突变,探究Bnavde在油菜与黑腐病菌互作中的功能。主要研究结果如下:(1)BnaVDE响应黑腐病菌和外源激素。采用qPCR对BnaVDE表达进行分析,发现甘蓝型油菜接种黑腐病菌后,BnaA06.VDE和BnaC05.VDE均显著上调表达。此外,GW-572016水杨酸(Salicylic acid,SA)、茉莉酸(Jasmonic acid,JA)和脱落酸(Abscisic acid,ABA)三种激素处理均可以诱导BnaA06.VDE和BnaC05.VDE表达。说明油菜BnaVDE响应黑腐病菌表达,并可能在SA、JA以及ABA介导的信号途径中起作用。(2)BnaVDE在油菜茎叶中高表达。实验室前期研究发现BnaA06.VDE和BnaC05.VDE在野生型油菜的根、茎、叶、花等组织器官中均有表达。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了BnaVDE缺失单突变体,分别为BnaA06.vde和BnaC05.vde。qPCR结果显示BnaA06.VDE在BnaC05.vde的茎叶中高表达,BnaC05.VDE在BnaA06.vde的茎叶中高表达,且BnaA06.VDE和BnaC05.VDE均在相互单突变体的叶片中表达量最高。(3)BnaVDE参与油菜对黑腐病的抗性。采用剪叶和喷菌两种接种方式,发现BnaA06.vde和BnaC05.vde单突变体植株的病害症状明显,发病程度显著高于野生型,表明油菜BnaVDE突变对黑腐病的抗性减弱。利用DAB染色和qPCR分析,观测到BnaA06.vde和BnaC05.vde单突变体油菜中H_2O_2积累减弱,Rboh D和Rboh F基因表达量下降。台盼蓝染色显示BnaA06.vde和BnaC05.vde单突变体在黑腐病菌接种后,死细胞更多,因此BnaVDE通过调节H_2O_2积累正调控油菜对黑腐病菌的抗temporal artery biopsy性。(4)BnaVDE突变影响ABA相关基因表达。为进一步探究BnaVDE介导的油菜对黑腐病菌的抗性与激素信号的相关性,采用qPCR对SA合成基因ICS1、SA受体基因NPR1、JA通路基因PDF1.2和MYC2、ABA生物合成基因NCED3和ABA受体基因PYL1在野生型和突变体油菜接种Xcc后进行分析。结果显示相较于野生型油菜,BnaA06.vde和BnaC05.vde单突变体油菜中NCED3和PYL1表达量下降,而ICS1、NPR1、PDF1.2和MYC2表达无显著差异,说明MCC950研究购买BnaVDE可能通过调节ABA信号介导油菜对黑腐病抗性。综上,BnaVDE通过调节H_2O_2和ABA信号正调控油菜对黑腐病的抗性,为解析油菜抗黑腐病的机理和油菜抗病育种提供参考。

【目的】了解2020―2021年猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的流行情况和遗传变异情况。【方法】本研究对中国部分地区73个猪场的525份样本进行RT-PCR检测，对检测为阳性的样本进行PEDV S1基因扩增与测序，并进行流行病GW4869体外学统计分析，使用DNAStar软件进行核苷酸相似性分析和氨基酸位点变异分析，利用Mega 6.06软件对PEDV S1基因进行遗传进化分析，对疑似重组的序列使用RDP4软件进行S1基因重组分析。【结果】在2020—2021年的525份临床样本中PEDV检出阳性率为26.29%(138/525)。流行病学统计分析显示，冬季属于PEDV高发季节，1日龄仔猪感染率最高，为42.75%(59/183),并在中国6个地区大范围流行。S1基因遗传进化分析显示，138株PEDV S1基因序列主要位于两个分支，131株毒株属于G2群，其中126株属于G2a亚群，与HBXY2、SNJ-P在同一亚群，5株属于delayed antiviral immune responseG2b亚群，与AJ1102、LW/L、S1SB431542浓度4在同一亚群；其余7株毒株位于G1群和G2群之间，形成一个独立分支。经重组分析发现，该分支的7株毒株存在同一种重组事件，断点位于第59―695 bp处，可能为跨群重组毒株；138个S1基因序列之间核苷酸相似性为85.7%～100%,与经典毒株CV777的核苷酸相似性为85.2%～92.3%,其中131株G2群分离毒株与经典毒株CV777相比，在S1基因N端第56、59-62、138-139、159-160位，与G2群参考株氨基酸序列存在相同并具有特征性的缺失和插入。【结论】2020―2021年PEDV流行株呈变异趋势，其主要流行基因型为G2群，与2010年以后流行的变异株亲缘关系较近，与经典毒株亲缘关系较远，且存在跨群重组，对中国持续监测PEDV流行性和变异性具有重要意义。

目的 分析基于Roy适应模AZD2281半抑制浓度式的心理护理在肺癌合并抑郁症患者中应用效果。方法 98例研究对象均为2022年1月～2022年12月烟台海港医院收治的肺癌合并抑郁症患者，以随机数字表分为对照组（n=49）与观察组（n=49）。对照组接受常规护理，观察组在常规护理的基础上应用基于Roy适应模式的心理护理。对比两组患者汉密顿抑郁量表（HAMD）、心理弹性量表（CD-RISC）、自我感受负担感受量表（SPBS）评分，以及护理满意度。正态计量资料采用t检验，计数资料采用x~2检验。结果 干预前两组HAMD、CD-RISRIPA Radioimmunoprecipitation assayC、SPBS分值对比，结果未见显著差异性（P>0.05）；干预12周后两组HAMD、CD-RISC及SPBS中情感负担、身体负担分值评分与干预前对比，差异有统计学意义（P<0.05），其中观察组HAMD分值显著低于对照组（P<0.05）,CD-RISC分值显著高于对照组（P<0.05）,SPBS中情感负担、身体负担分值显著低于对照组（P<0.05）。护理后观察组满意度显著高于对照组（P<0.05）。结论 基于Roy适应模式的心理护理对于肺癌合并抑郁症患者的抑郁Tofacitinib作用症状具有显著的改善作用，利于增强其心理弹性，缓解自我负担感受，且提高了护理满意度。

目的 探讨治疗宫缩乏力性产后出血宫缩剂的使用情况及其疗效，为其合理运用提供参考。方法 通过信息系统提取筛选2021年1月至12月我院收治的宫缩乏力性产后出血患者病历83例，将卡前列甲酯栓联合麦角新碱注射液治疗组14例纳入对照1组，卡前列甲酯栓联合卡前列素氨丁三醇注射液治疗组14例纳入对照2组Liraglutide说明书，卡前列甲酯栓联合麦角新碱注射液及卡前列素氨丁三醇注射液治疗组55例纳入观察组。对宫缩剂使用情况进行回顾性分Oral bioaccessibility析，按照宫缩剂的使用情况进行分组，观察不同组别的止血效果、出血情况、血红蛋白下降情况等。结果 观察组治疗有效率为98.12%，高于对照1组和对照2组，差异有统计学意义（P<0.05）。治疗前，观察组出血量高于对照1组和对照2组，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗后各时间段三组出血量比较，差异无统计学意义（P>0.05）;55例未进行输血LY294002分子式治疗的产妇平均下降（26.9±11.4）g/L，三组的Hb下降量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 卡前列甲酯联用麦角新碱与卡前列素氨丁三醇对宫缩乏力性产后出血（特别出血量≥1 000 ml）能够迅速止血，可用于产后大出血的抢救。

对香豆酸(p-CA)是一种具有生理活性的酚酸类化合物,也是众多苯丙素类化合物的合成前体,在营养、制药、材料和化学工业中有许多重要的应用。在微生物中合成对香豆酸有两条生GSK2118436作用物途径,分别以L-苯丙氨酸(PAL支路)和L-酪氨酸(TAL支路)为前体。目前微生物合成对香豆酸的最高产量是利用酿酒酵母工程菌通过协同苯丙氨酸解氨酶(PAL)和酪氨酸解氨酶(TAL)途径完成。在大肠杆菌(Escherichiacoli)中,多以酪氨酸为底物转化合成香豆酸。在本文中,以高产L-苯丙氨酸的大肠杆菌作为底盘菌株,构建基于PAL途径生产对香豆酸的工程菌株,具体结果如下:(1)PAL支路合成酶的筛选和体外测评。在9种候选PAL中,来自粘红酵母(RgPAL)、拟南芥(AtPAL2)、蓝藻细菌(AvPAL)的PAL比酶活分别为3.11、1.88和1.60 U·mg~(-1),其中AtPAL2酶能更好地在E.coli中可溶性表达而被选择。筛选出5种Captisol体外候选C4H,综合可溶性表达和酶活测试结果,选择黄花石蒜来源的LauC4H。进一步利用“GSTSSGSG”融合表达策略,优化了还原伴侣(AtATR2)和LauC4H的连接,转化得13.48μM对香豆酸。此外,对AtPAL2和LauC4H酶的蛋白表达条件和体外催化能力进行测试。当菌浓OD600=0.8时添加0.4 mM的IPTG,分别在25℃和16aviation medicine℃下诱导15 h,AtPAL2和LauC4H可溶性表达最好;测试AtPAL2和LauC4H催化能力最佳条件分别在 50℃、pH=9 和 25℃、pH=7.5。(2)对香豆酸体外合成模块中限速酶的改造。利用纯化后等量的AtPAL2和LauC4H进行体外转化L-苯丙氨酸,通过液质联用(HPLC-MS)和高效液相色谱(HPLC)检测到对香豆酸,验证了对香豆酸合成路径的可行性。当LauC4H浓度增加2倍时,其L-苯丙氨酸到p-CA初始反应速率增加1.9倍;同时AtPAL2的k_(cat)/K_m 比LauC4H高22倍,综合确定LauC4H为限速酶。通过对LauC4H酶的半理性设计,筛选出11个候选残基,其中 LauC4H~(V91A)、LauC4H~(V278S)、LauC4H~(S187T)使p-CA 的产量分别达到 12.13μM、11.65 μM、15.37 μM,比LauC4Hwt分别提高42.1%、36.4%、80%,而三个突变体随机组合的双突变体和三突变体效果不佳。最后,对LauC4H~(S187T)进行六种“N”端修饰。经验证“KKK”修饰下对香豆酸产量相较于原始菌株提高了 2.88倍,有助于提高LauC4H的正确折叠和定位。(3)p-CA合成菌株的构建与优化。构建质粒pEMAL7转化到E.coli JNYPQ-5中,获得的菌株JNYPQ-12能够利用葡萄糖合成p-CA。用不同强度的启动子调整AtPAL2与LauC4H的表达水平,当AtPAL2和LauC4H分别以PT5和Ptac组合时,恒温25℃发酵,p-CA产量为15.7 μM。研究发现NADPH对p-CA的生产起着关键的作用。为增强辅因子NADPH的供给,过表达zwf和gnd基因,工程菌株E.coli JNYPQ-16的NADP+/NADPH比值比JNYPQ-12提高了 83.9%,摇瓶水平达到38.4 μM。(4)5 L发酵罐测试菌株发酵能力。从温度和培养基中酵母粉的添加浓度优化底盘菌生产L-苯丙氨酸的能力,酵母粉浓度增加至5 g/L,菌体先在33.5℃下生长至OD_(610)为20左右再转为38.5℃发酵时,L-苯丙氨酸的产量、得率以及生产强度分别提高至64.9 g/L、0.259 g·g~(-1) 和 1.47g/L/h。初步评估 IPTG 添加时间对工程菌E.coli JNYPQ-16产p-CA的影响,当OD_(610)为10时,添加IPTG诱导,p-CA产量达到378.6μM,平均生产强度达1.29mg/L/h。本研究通过对PAL支路合成酶PAL和C4H的筛选和改造,使其在大肠杆菌中更好地表达。进而优化PAL支路在L-苯丙氨酸底盘菌中的表达,实现对香豆酸从头积累,为对香豆酸及相关苯丙素类化合物的微生物合成奠定一定基础。对C4H酶的功能改造,以及提升p450对芳烃的羟基化反应效率提供一定参考。