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为了解决目前补钙剂存在的吸收率低、稳定性差等问题,本研究以玉米肽、氯化钙、β-环糊精为原料,研制了一种新型的玉米肽钙螯合物微胶囊,达到提高钙的吸收性和稳定性的目的,同时赋予其抗氧化和降血压的功能活性。本文对玉米肽钙螯合物及其微胶囊的制备工艺进行了优化,且对玉米肽与钙离子的螯合机制进行了探讨,并从细胞水平分析了其钙离子的生物利用率,还测定了微胶囊的结构及其稳定性和释放率。主要结论如下:(1)通过单因素和响应面试验得到制备玉米肽-钙螯合物的最佳参数:多肽浓度36 mg/m L、肽钙比8:1、p H 7、温度40°C、时间40 min。此时,螯合率和得率达到87.59%和38.45%,并采用Na S_2定性法验证了玉米肽-钙螯合物的形成。(2)紫外光谱中羰基特征峰的迁移表明玉米肽与钙离子发生了螯合反应。红外光谱(FTIR)判断出钙离子螯合的主要位点是氨基酸上的羧基、氨基、羰基等。X射线光电子能谱(XPS)和能谱仪(EDS)结果发现的Ca峰以及X射线衍射(XRD)在2θ=7.06°和25.62°处形成了两个新的衍射峰均可证明玉米肽与钙之间发生了螯合反应。扫描电镜(SEM)表明螯合物呈现出密集的晶体状结构。表面微观结构(原子力显微镜和粒径)观察的结果表明螯合后样品尺寸减小,且分布更均匀。氨基酸成分研究表明钙离子的螯合与酸性氨基酸Asp、Glu以及碱性氨基酸Lys、His密切相关。Zeta电位显示螯合物表面的负电荷数量减少,进而证实了羧酸基团是肽钙结合的主要位点之一。(3)分别比较了螯合前后玉米肽和玉米肽-钙螯合物的DPPH、羟自由基清除能力和ACE抑制活性。结果表明,螯合后的玉米肽-钙螯合物的抗氧化能力显著高于玉米肽,说明螯合反应有利于提高玉米肽的抗氧化性,但对ACE抑制活性无显著影响。TGA和DTG的结果显示螯合物的最大热分解温度为316°C,且其热分解稳定性比玉米肽更好。不同环境下的稳定性结果表明,螯合物在p H 4-10范围内保持良好的稳定性(保留率≥69.25%);在40-70°C范围内稳定性较好(保留率≥64.17%);体外模拟胃肠消化结果证实玉米肽-钙螯合物具有较高的钙离子保留率(57.95%),与等量钙离子含量的Ca Cl_2(15.07%)相比,消化稳定性显著提高。(4)通过建立Caco-2细胞吸收转运模型对玉米肽-钙螯合物的吸收特性进行评价,结果显示,螯合物经过不同肠消化时间0.5、1和2 h处理后钙的生物利用率(46.14%、48.08%和46.52%)对样品浓度和吸收时间有依赖性,且均显著高于Ca Cl_2(33.83%),证明了螯合物在人体肠道中具有良好的吸收性能。(5)通过单因素和正交试验得到制备玉米肽-钙螯oncology access合物微胶囊的最佳参数为:螯合物浓度5 mg/m L、螯合物与β-CD的质量比1:8、超声功率75 W、间歇比20s/5 s、时间20 min。在此条件下,包埋率为83.69%,得率为90.57%,微胶囊的平均粒径为859.76 nm,PDI为0.281,Zeta电位为-15.11 m V,相较于未超声处理制备的微胶囊,超声处理使得包埋率提高了20.36%、得率提高了15.65%,平均粒径减小了329.09 nm,表明超声波处理能显著提高螯合物的包埋效果和降低微胶囊粒径尺寸。(6)FT-IR结果表明,螯合物通过分子内氢键稳定在β-CD腔中;SEM结果表明微胶囊呈现更小尺寸的规则的晶体结构,EDS结果中发现的Ca含量证明了微胶囊的形成;AFM和粒径研究发现INCB28060包埋后微胶囊颗粒粒径处于螯合物与β-CD之间且分布均匀。Zeta电位分析结果表明微胶囊带负电荷,XRD在2θ=27.09°处形成了新的衍射峰进一步证明了微胶囊具有新的结晶相。TGA和DTG的结果表明微胶囊具有良好的热分解稳定性,最大热分解温度为295°C。玉米肽钙微胶囊在不同p H条件下的溶解度显示与未包埋的螯合物相比,微胶囊在p H 2-10具有更高的溶解度,表明微胶囊包埋可以很好地提高钙离子的溶解能力。稳定性试验结果表明,微胶囊在p H 2-10之间能保持较高的酸碱稳定性,其在p H<6下的Nirogacestat说明书保留率≥69.6%,在p H>6时的保留率≥94.4%;在40-80°C的范围内表现出了良好的热稳定性(保留率≥84.8%);体外模拟胃液和肠液消化研究表明,钙离子释放率为:Ca Cl_2>玉米肽-钙螯合物>玉米肽钙微胶囊,表明将螯合物包埋在β-CD不仅能减轻钙离子在胃液中的突释,还能够实现其在小肠中的缓释。

目的 分析lncRNA C2dat2调控小鼠大脑中动脉栓塞再灌注损伤(MCAOBreast biopsy/R)及神经元自噬、凋亡的作用机制。方法 构建小鼠MCAO/R模型，实验分为假手术组、模型组、negative shRNA组和C2dat2 shRNA组。HE染色检测大脑组织病理学变化，改良神经功能缺陷评分评估小鼠神经功能，TUNEL染色检测大脑组织细胞凋亡水平，荧光定量PCR检测脑组织半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、磷酸化p38丝裂原活获悉更多化蛋白激酶(p-p38MAPK)mRNA表达。Western blotting检测脑组织自噬蛋白水平。结果 模型组小鼠脑组织病理损伤明显，降低C2dat2表达后病理损伤明显改善。除假手术组外，神经功能缺陷评分其他组均随时间依次下降，且C2dat2 shRNA组低于negative shRNA组(P<0.05)。细胞凋亡率模型组和negative shRNA组高于假手术组，C2dat2 shRNA组低于negative shRNA组(P<0.05)。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Belin 1、Caspase-3和p-p38MAPK表达水平模型组和negative shRNA组高于假手术组，C2dat2 shRNA组低于negative shRNA组获悉更多(P<0.05)。结论 C2dat2表达下调可减轻小鼠MCAO/R损伤，抑制细胞自噬和凋亡，其机制可能与MAPK信号通路有关。

目的 探讨超声对导管型乳腺癌(DBC)与导管内乳头状瘤(IDP)患者的鉴别诊断。方法本研究为回顾性研究,以我院2017年1月～2020年12月收治的110例乳腺疾病患者作为研究对象,其中DBC患者59例,IDP患者51例,分析两组患者的常规超声、超声血流情况之间的差异,分析及Logistic回归诊断模型。结果IDP以及DBCSoil remediation患者的导管形态(χ~2=25.69.2,P<0,001)、导管selleck抑制剂走行(χ~2=20.321,P<0.001)、导管壁回声(χ~2=6.052,P=0.014)及钙化灶情况(χ~2=34.552,P<0.001)的差异有统计学意义,两组患者的血流分布之间的差异有统计学意义(χ~2=22.441,P<0.001),但两组血流分级之间的差异无统计学意义(P>0.05);通过多因素分析,患者的导管、导管走行、导管壁回声、钙化、血流分布Compound 3抑制剂均是DBC诊断的重要因素。结论超声对DBC与IDP患者具有较强的鉴别诊断意义,导管增粗、导管走行不规则、导管壁回声不清晰、钙化不明显、血流分布均是DBC诊断的重要依据。

目的 研究靶向B细胞特异性小鼠白血病病毒插入位点1(Bmi-1)的小分子抑制剂PTC-596对人乳腺癌MCF-7细胞侵袭迁移的影响及作用机制。方法 体外培养MCF-7细胞，分空白组(正常培养)和低、高浓度实验组(25,50 nmol·L~(-1) PTC-596)均培养48 h。以划痕愈合实验和Transwell法检测细胞迁移和侵袭能T-cell mediated immunity力，以克隆形成实验检测单克隆细胞群生长能力，以蛋白质印迹法检测Bmi-1、上皮钙黏素(E-cadherin)、神经钙黏素(SB203580 IC50N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达。结果 空白组与低、高浓度实验组24 h划痕愈合能力分别为(76.32±3.64)%,(20.39±2.83)%,(1.32±2.CH-223191临床试验49)%;迁移细胞数分别为407±38,122±35,41±13,侵袭细胞数分别为287±23,82±21,34±9;Bmi-1蛋白相对表达量分别为1.00±0.05,0.49±0.03,0.20±0.01;E-cadherin相对表达量分别为1.00±0.15,3.79±0.13,7.41±0.21;N-cadherin相对表达量分别为1.00±0.00,0.82±0.01,0.29±0.01;Vimentin相对表达量分别为1.00±0.01,0.75±0.01,0.31±0.01;MMP-2相对表达量分别为1.00±0.02,1.17±0.04,0.47±0.04;MMP-9相对表达量分别为1.00±0.02,0.63±0.04,0.32±0.03。低、高浓度实验组与空白组相比，差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论 Bmi-1抑制剂PTC-596能高效抑制人乳腺癌MCF-7细胞迁移和侵袭能力，机制可能与影响MCF-7细胞上皮-间质转化进程相关。

肠道病毒-A71型(EV-A71)重症感染患儿多表现为过激的炎症反应，病毒感染引起的细胞焦亡可能是机体炎症发生的重要原因之一。本文旨在探究姜黄素对EV-A71病毒感染引起的细胞焦亡与细胞损伤的保护作用及可能的机制。首先，观察了姜黄素对EV-A71引起的细胞毒性的影响。CCK8检测结果显示，EV-A71感染降低细胞的增殖活力；LDH测定表明，病毒增加细胞培养上清中LDH的释放，造成了细胞的损伤；DAPI核染色及Dil细胞膜染色后观察到，EV-A71感染引起了细胞的形态变化和数量减少。姜黄素可以逆转病毒引起的上述变化，提示姜黄素对病毒感染的细胞毒性具有保护作用。细胞焦亡发生时，可Crizotinib生产商促进炎症因子IL-1β的成熟、产生和释放。我们观察了EV-A71及姜黄素干预对细胞IL-1β产生的影响。Western印迹结果显示，病毒感染细胞内IL-1Medically-assisted reproductionβ的活化增加。ELISA检测结果显示，EV-A71病毒感染引起细胞上清中IL-1β的分泌水平增加；qPCR测定结果显示，EV-A71病毒感染细胞中IL-1β的转录水平上调；而姜黄素干预可抑制染毒细胞IL-1β的活化和分泌。Western印迹检测细胞内焦亡相关分子的变化。结果显示，EV-A7购买CP-6905501感染可诱导细胞发生焦亡，并呈时间和剂量依赖性，分子NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、GSDMD、胱天蛋白酶1(caspase-1)参与EV-A71诱导细胞发生的焦亡；姜黄素干预可以有效抑制EV-A71诱导的细胞细胞焦亡。另外，Western印迹检测显示，姜黄素可以减少细胞内EV-A71结构蛋白VP1的水平，通过检测细胞上清中病毒的CCID50发现，姜黄素可以降低细胞上清中病毒的滴度。最后，对姜黄素抗焦亡机制进行了探索，发现EV-A71感染诱导了细胞自噬并激活了p38/NLRP3通路，姜黄素能抑制自噬标志蛋白LC3及自噬底物p62的降解，并抑制p38/NLRP3的激活。总之，本研究明确了姜黄素通过对自噬溶酶体阶段及p38/NLRP3通路的抑制，有效减轻了EV-A71诱导的细胞焦亡，为姜黄素在抗EV-A71感染的临床应用提供参考。

研究背景脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)引发神经系统运动及其他生理功能障碍。目前尚无可行、有效的治疗手段。因此,深入研究并揭示脊髓损伤的病理生理机制,寻找thyroid autoimmune disease减轻脊髓损伤、促进修复的特异性干预靶点,是神经科学领域急需攻克的重要医学科学问题。小胶质细胞是中枢神经系统的固有免疫细胞,在神经系统内环境稳态维持、抗感染免疫、神经系统损伤修复过程中发挥重要作用。但是小胶质细胞在SCI后炎症反应和组织修复中具体作用及分子机制亟需阐明。MS4A6C(人MS4A6A的鼠同系物),是4次跨膜结构域膜分子MS4A基因家族成员,研究表明,MS4A6C主要表达于小胶质细胞等免疫细胞膜表面。在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型,单细胞RNA测序和分子生物学验证实验均表明MS4A6C在小胶质细胞表达显著上调,提示其在小胶质细胞介导的神经系统炎症反应中可能发挥重要作用,但脊髓损伤条件下,小胶质细胞膜MS4A6C表达的时空特征尚不清楚,小胶质细胞膜MS4A6C在脊髓损伤后炎症反应及组织修复中的具体作用及分子机制如何?深入研究这些重要的科学问题有助于阐明小胶质细胞在SCI中的生物学作用,有望发现能够减轻脊髓损伤、促进修复的特异性干预靶点,具有重要的生物学意义和临床应用价值。研究目的:1.明确脊髓损伤病理条件下,小胶质细胞膜MS4A6C表达的时间变化和空间定位特征。2.明确MS4A6C敲低对脂多糖诱导的小胶质细胞炎症反应的影响及机制。3.转录组测序分析并验证MS4A6C调节小胶质细胞炎症反应可能分子机制。研究内容:1.MS4A6C多肽抗原免疫后血清效价分析及小鼠脊髓组织对抗体进行验证;8周龄C57BL/6J雄性小鼠,行脊髓损伤手术,术后第3天、第7天和第14天处死小鼠,用于Q-PCR,Western Blotting检测MS4A6C的表达;免疫荧光检测脊髓损伤后局部IBA-1~+-MS4A6C~+小胶质细胞。2.BV2小胶质细胞脂多糖刺激后Q-PCR检测6h、12h和24h MS4A家族其它成员和MS4A6C的表达;MS4A6C慢病毒感染BV2小胶质细胞的条件摸索;脂多糖刺激BV2小胶质细胞浓度的摸索;Q-PCR检测MS4A6C敲低后小胶质细胞炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达。3.小胶质细胞LV3-NC+LPS组和LV3-MS4A6C-660+LPS组进行转录组测序,进行测序数据质控总览,参考基因组比对区域分布,基因表达水平分析,差异表达基因上下调频数统计,差异基因表达水平火山图分析,差异表达基因聚类分析和差异表达基因GO功能与KEGG通路注释;Q-PCR方法检测差异表达基因GDF15、Ube2L3、Zfand3、Med6、gbp2。研究结果:1.8周龄C57BL/6Dolutegravir分子量J雄性小鼠,成功建立脊髓损伤模型,并且损伤局部炎症因子表达水平明显增加;小鼠经MS4A6C多肽抗原5次免疫,取血,ELISA方法测定血清效价,所有小鼠血清效价均≥32K,其中以M01,M05号小鼠血清及组织抗体验证效果最佳;脊髓损伤后小鼠MS4A6C m RNA水平呈上升趋势,显著高于其对照小鼠;同样MS4A6C蛋白水平在脊髓损伤后3d升高;免疫荧光实验显示脊髓损伤后局部IBA-1~+FGFR抑制剂-MS4A6C~+小胶质细胞浸润明显。2.LPS刺激后BV2小胶质细胞MS4A家族成员表达均发生改变。其中MS4A6C随着LPS刺激的时间增加,在MS4A家族成员中呈现先升高后降低的趋势,在12h时与对照相比,升高7倍,在LPS刺激后的MS4A家族成员中升高倍数最高;50 MOI慢病毒感染BV2小胶质细胞48h,LPS 50ng/m L刺激12h后,MS4A6C基因敲低约60%-70%,与处理对照相比达到显著性水平;BV2小胶质细胞敲低MS4A6C基因后,能减轻炎症反应,TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平下降。3.转录组测序共构建了8个测序文库,包括4个LV3-NC+LPS组和4个LV3-MS4A6C-660+LPS组链特异性文库;链特异性文库文库获得398814810条高质量测序数据;经质控分析后,Q20%、Q30%和GC含量也都满足后续分析要求,且质量较高;经过比对,大多数都测序数据主要比对到Exon区;比较LV3-NC+LPS组和LV3-MS4A6C-660+LPS组发现,140个基因上调,29个基因下调;GO富集分析表明差异表达基因涉及细胞质、细胞膜、细胞外间隙、胞外区、蛋白质结合、金属离子结合和钙离子结合等;KEGG通路富集分析表明差异表达基因涉及细胞外基质受体相互作用、粘着斑、感染等通路富集。研究结论:1.脊髓损伤局部MS4A6C m RNA和蛋白表达均上调,MS4A6C~++IBA-1~+小胶质细胞在脊髓损伤局部的浸润显著增加。2.MS4A6C敲低可减轻脂多糖(LPS)诱导的BV2小胶质细胞炎症反应,降低炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平。3.转录组测序表明MS4A6C调控BV2小胶质细胞炎症反应,MS4A6C敲低引起细胞外基质互作、组织修复功能相关的基因差异性表达及通路富集改变。

目的 探讨心脏彩超在冠心病节段性室壁运动异常患者中的应用价值。方法 选取2018年1月至2020年2月本院收治的54例冠心病节段性室壁运动异常患者作为研究对象，分别进行心脏彩超、shelter medicine冠状动脉造影检查，以冠状动脉造影诊断结果为金标准，分析心脏彩超的诊断符合率及灵敏度、特异度、准确性。结果 冠状动脉造影检查结果显示，54例患者均确诊为冠心病节段性室壁运动异常；心脏彩超共检出52例冠心病节段ERK抑制剂性室壁运动异常，诊断符合率为96.30%(52/54)，另外2例为节段性室壁运动正常；心脏彩超诊断确诊率为96.30%、灵敏度为98.04%、特异度为66.67%。结论 心脏超声诊断冠心病节段性室壁运动异常Barasertib可获得与冠状动脉造影相近的诊断价值，能为临床诊治方案的制订提供依据，且操作方便、费用低，更易被患者接受，值得临床推广应用。

目的：探讨保乳术（Breast conserving surgery,BCS）联合乳房整形术对乳腺癌患者术后乳房美观度及并发症的影响。方法：选取医院2019年3月-2020年5月收治的乳腺癌患者119例，根据选取手术方法不同分为对照组（n=57）和研究组（n=62），对照Mirdametinib MW组行BCS治疗，观察组在对照组基础上联合乳房整形术。观察两组围术期并发症发生情况；随访1年，统计分析两组术后乳房美观度及生活质量变化，并记录两组术后并发症发生情况。结果：住院期间，研究组切口裂开、血肿及切口感染发生率均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。术后6个月，两组情绪角色Lorlatinib半抑制浓度、躯体功能、肢体疼痛、社会功及总体健康评分均高于术前，且研究组术后乳房美观度、简明健康量表36(Shortform-36,SF-36)各指标评分均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。随访1年，两组术后皮瓣坏死、脂肪坏死、皮肤皱缩Bioreactor simulation及肿瘤复发发生率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：BCS联合乳房整形术能有效改善乳腺癌患者术后美观度，安全性较好。

炎症是机体对感染、伤害或化学刺激引起的防御反应。然而,不受控制的过度炎症反应对身体有害,并与许多疾病的发展有关。目前,常用的抗炎药物因其具有多种副作用而在实际应用中逐渐受到限制。Dolutegravir配制食源性生物活性肽具有来源广泛、易吸收、安全性高等优点,在炎症的防治中具有广阔的应用前景。蚕蛹资源丰富,营养价值高,但由于深加工技术缺乏,应用局限,资源利用率低。另外,蚕蛹及其相关产物被报道具有多种活性,但对其抗炎活性鲜有报道,作用机制尚不清楚。微生物发酵法已从天然资源中分离纯化出多种生物活性肽,但对抗炎肽的研究尚属空白,大部分的抗炎肽主要通过酶解法制备得到。因此,本论文通过纳豆菌液态发酵制备蚕蛹肽,基于细胞炎症模型评价其抗炎活性并探究其作用机制,以期为蚕蛹高值化利用和食源性抗炎活性肽的研究与开发提供了理论依据。本论文主要研究内容与结果如下:采用纳豆菌对三种不同蚕蛹原料(蚕蛹、脱脂蚕蛹、蚕蛹蛋白)进行液态发酵,通过LPS诱导RAW264.7巨噬细胞建立炎症模型,以一氧化氮(nitric oxide,NO)释放量为指标,评价其发酵产物的抗炎活性。结果表明:三种不同蚕蛹原料发酵产物中,蚕蛹蛋白发酵产物的多肽得率最高。三种经纳豆菌发酵的产物对RAW264.7巨噬细胞均无毒性,并且对细胞生长起到一定的促进作用。其中蚕蛹蛋白发酵产物的抗炎效果最好,以剂量依赖性的方式显著降低NO的释放量。通过单因素实验和响应面试验对蚕蛹肽的制备工艺进行研究,确定最佳发酵工艺条件。结果表明:在每100 m L的发酵底物中,添加2.6 g蚕蛹蛋白,接种量纳豆菌5.0 m L(种子液浓度为10~7～10~8CFU/m L),在初始p H 7.0、发酵温度37℃时发酵35.4 h,此条件下的多肽得率最高为14.58%,同时获得的蚕蛹蛋白发酵产物在LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞体外炎症模型中表现出较好的抗炎活性。采用超滤和半制备液相技术对蚕蛹肽进行分离纯化,结果表明:SPP-I-F4分离组分具有较强抗炎活性。采用质谱技术对其结构进行鉴定,并通过生物信息学筛选最有前途的抗炎肽。结果显示:SPP-I-F4分离组分经质谱鉴定得到7条多肽,其中最具抗炎潜力的肽序列为GYALPHAILR和YALPHAILR,均为首次报道。考察GYALPHAILR和YALPHAILR这两条蚕蛹抗炎肽对炎症介质(如NO、细胞因子)的抑制作用,以及利用蛋白质免疫印迹(Western-blot)技术分析蚕蛹抗炎活性肽对炎症信号通路表达的影响selleckchem。结果表明:两种蚕蛹抗炎肽对细胞均无毒性,可有效抑制细胞炎症模型中NO、IL-1β和IL-6的分泌(p<0.05),并且通过调控丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路发挥抗炎作用。综上研究表明,通过纳豆菌发酵方式可从蚕蛹蛋白中获得抗炎活性明确的发酵产物,经分离得到结构新颖的2条抗炎活性肽,其通过抑制NOimmune T cell responses、炎症因子及调控MAPK和NF-κB信号通路发挥抗炎作用。论文研究结论为蚕蛹蛋白促健康产品的开发提供了理论与技术支撑。

研究背景与研究目的:肝脏是人体内脏里最大最重要的器官,以代谢功能为主。在人体内不仅能去氧化、储存肝糖原、合成分泌型蛋白质,在药物和毒素的代谢、解毒等方面也起着关键作用。急性肝衰竭(Acute liver failure,ALF)是一种以肝功能突然下降继发的黄疸、凝血障碍、肝性脑病等为特征的临床综合征,影响多脏器功能,死亡率高达90%。原位肝移植是治疗ALF的有效方法之一,但由于肝脏供体有限、移植费用高昂,genetic breeding严重制约了ALF患者接受肝移植治疗的覆盖率,使其不能成为临床普及的治疗方法。因此,寻找新的治疗ALF的方法势在必行。人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UCMSCs)是一种具有自我更新能力和多向分化的基质细胞。有学者发现间充质干细胞能通过旁分泌的方式产生一些具有修复作用的细胞因子,可作用于肝脏和肾脏,以促进其相应的损伤修复。外泌体属于细胞外囊泡的一种,干细胞来源的外泌体在各类疾病尤其是肝脏疾病治疗方面具有良好的潜能,在再生医学、疾病模型、药物筛选以及精准医疗等领域均具有广阔的应用前景。人脐带间充质干细胞来源的外泌体(Human umbilical cord mesenchymal stem cells exosomes,h UCMSC-Exo)对ALF是否具有治疗作用?h UCMSC-Exo治疗ALF的作用机制和分子机制具体是什么?到目前为止,均鲜有相关报道。本文旨在探讨h UCMSC-Exo对治疗对乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)诱导的ALF的作用机制及其生物学原理,从而为治疗ALF的新靶点和新方法的探究提供实验依据。实验方法:1.h UCMSCs及h UCMSC-Exo的分离、培养及鉴定:1)采用胶原酶II消化法从脐带上分离、培养h UCMSCs;2)利用流式细胞术检测h UCMSCs表面分子标志;3)成骨成脂分化检测h UCMSCs体外多向分化潜能;4)超速离心法提取h UCMSC-Exo,并利用透射电镜分析h UCMSC-Exo形态及粒径;5)使用Western blot法检测h UCMSC-Exo标志蛋白。2.h UCMSC-Exo抑制APAP诱导的急性肝衰竭小鼠肝细胞的坏死和凋亡的潜能及作用机制研究:1)以380 mg/kg剂量注射APAP后,评估经过尾静脉注射PBS或者h UCMSC-Exo的APAP损伤的小鼠的生存率,再利用尾静脉注射PKH26标记的h UCMSC-Exo经过活体成像确定作用部位;2)利用HE染色及TUNEL凋亡染色检测不同组别小鼠肝脏中肝细胞凋亡;通过肝功能分析检测不同组别小鼠肝功能情况;3)利用免疫荧光和酶标仪等检测测定急性肝衰竭小鼠体内与氧化压力相关的一系列指标,如GSH、SOD、MDA、4-HNE、CYP2E1等;4)利用q RT-PCR检测ALF小鼠体内炎症因子的表达。3.h UCMSC-Exo抑制肝细胞坏死并促进损伤修复的分子机制研究:1)体外利用APAP建立人正常肝细胞系LO2的肝衰竭模型,并利用PKH26标记的h UCMSC-Exo与LO2细胞共培养观察细胞摄取情况;2)检测正常培养组、损伤组、损伤后h UCMSC-Exo共培养组ROS和MDA等氧化指标的变化;3)利用Annexin V/PI流式细胞凋亡实验、CCK8实验、Western blot实验检测正常培养组、损伤组、损伤后h UCMSC-Exo共培养组细胞的凋亡和增殖情况;4)Western blot检测正常培养组、损伤组及h UCMSC-Exo组细胞中IGF-1R-PI3K-AKT及ERK1/2信号通路相关蛋白表达;5)损伤后h UCMSC-Exo共培养组细胞中加入LY294002(AKT抑制剂)及PD98059(ERK1/2抑制剂),利用Annexin V/PI流式、CCK8及Western blot检测上述信号通路在h UCMSC-Exo抑制肝细胞坏死并促进损伤修复中发挥的作用。实验结果:1.h UCMSCs及h UCMSC-Exo的特性:1)利用胶原酶II消化法可从脐带上分离培养得到具有长梭形形态的h UCMSCs,且h UCMSCs细胞形态有呈漩涡状生长或平行排列的趋势;2)流式细胞技术表明h UCMSCs表达间充质干细胞标志基因CD105、CD73、CD90、CD29,不能表达造血干细胞相关标志基因CD34及CD45;3)h UCMSCs体外在适当条件下可分化为脂肪细胞和骨细胞;4)透射电镜表明h UCMSC-Exo为直径在30-150 nm的囊泡;5)h UCMSC-Exo表达外泌体标志蛋白CD9、CD63、CD81和Rab5。2.h UCMSC-Exo体内移植可通过抑制肝细胞的凋亡、缓解氧化应激压力促进APAP所诱导的急性肝衰竭损伤修复:1)h UCMSC-Exo体内移植能明显改善ALF小鼠的生存率,活体成像显示大部分h UCMSC-Exo在肝脏富集;2)TUNEL凋亡检测点击此处表明h UCMSC-Exo可以抑制肝细胞凋亡,HE染色显示h UCMselleck抑制剂SC-Exo能明显减少APAP所导致的肝小叶中心坏死,肝功能指标检测表明h UCMSC-Exo能明显改善ALF小鼠的肝功能;3)h UCMSC-Exo能显著恢复ALF小鼠体内GSH、SOD活性,抑制MDA含量的升高。免疫荧光染色法显示h UCMSC-Exo能明显逆转ALF小鼠肝组织中4-HNE和CYP2E1的过表达;4)q RT-PCR检测表明h UCMSC-Exo可使APAP损伤的肝组织中促炎细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α显著降低。3.h UCMSC-Exo通过活化IGF-1R/PI3K/AKT和ERK1/2信号通路抑制APAP损伤LO2细胞氧化压力及凋亡:1)h UCMSC-Exo容易被LO2细胞所摄取;2)h UCMSC-Exo能降低APAP损伤的LO2细胞内的ROS和MDA的含量;3)h UCMSC-Exo通过激活IGF-1R/PI3K/AKT和ERK1/2信号通路抑制APAP损伤LO2细胞氧化压力及凋亡。结论:1.h UCMSCs增殖能力强、表达间充质干细胞标志基因、不表达造血干细胞标志基因,具有多向分化潜能,可定向分化为脂肪细胞及骨细胞。其衍生的外泌体粒径大小在在30-150 nm之间,且表达外泌体标志蛋白;2.h UCMSC-Exo体内移植能促进APAP诱导的急性肝衰竭小鼠肝功能的恢复,其机制与h UCMSC-Exo抑制损伤的肝细胞的坏死、凋亡以及减缓氧化应激有关;3.h UCMSC-Exo能够被LO2细胞所摄取,然后通过激活APAP损伤LO2细胞中的IGF-1R/PI3K/AKT和ERK1/2信号通路,进而抑制APAP损伤LO2细胞氧化压力及凋亡。