基于16S rDNA高通量测序技术研究人参对LPS诱导的抑郁样行为小鼠肠道菌群的影响

目的 研究人参对脂多糖(Iipopolysaccaride,LPS)诱导的抑郁样行为小鼠肠道Drug Screening菌群的影响。方法 将小鼠随机分为空白组(Con)、模型组(Mod)、人参水提物组(GS)、盐酸氟西汀组(Flu);给药7 d后,进行旷场实验和悬尾实验,观察小鼠的行为学表现,并使用16S rDNA技术检测各组小鼠粪便肠道菌群变化及预测抑郁样行为小鼠肠道菌群相关的功能通路。结果 与模型组相比,人参水提物组小鼠的活动次数和休息时间明显减少,活动总路程及平均速度显著增加;人参水提物组肠道菌群从门到属水平均发生了变化,部分有益菌的丰度增加,部分有害菌的丰度降低,其中厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌属(BaProteases抑制剂cteroides)、毛螺菌属(Lachnospiraceae_FCS020_group)、瘤胃菌属(Ruminococcaceae_UCG_009)、Lachnoclostridium菌属显著增多,均有往正常组回调的趋势;KE获悉更多GG通路富集分析共发现31条功能通路与抑郁样行为小鼠肠道菌群相关。结论 人参具有改善抑郁样行为小鼠肠道菌群失调的作用。

胱硫醚裂解酶的克隆表达、酶学性质及分子改造研究

硫代亚磺酸酯类化合物具有抑菌、降血脂、降血压、抗癌、抗氧化等功效,广泛应用于农业、医药业以及养殖业等行业。目前该类化合物的生产主要通过化学合成或植物提取获得。植物提取过程复杂,受热会分解成二烯丙基硫醚类化合物,使其药用效果大大降selleck抑制剂低。化学合成则存在产率低和污染严重等问题,极大限制了其在不同行业的大规模应用。酶法催化合成硫代亚磺酸酯类化合物的生产工艺具有绿色高效等优点,具有广泛的应用价值,其中大蒜素相关应用研究最为广泛。催化生成大蒜素等硫代亚磺酸酯类化合物的蒜氨酸酶主要存在于大蒜等百合科植物的液泡当中,酶的产量有限且提取工艺复杂。利用微生物异源表达蛋白已经成为获取酶最简单快速的方法,但表达植物源蒜氨酸酶存在包涵体多表达困难等技术难题。因此,微生物来源的同工酶具有易于实现异源表达和规模化生产的优势,在酶法合成硫代亚磺酸酯类化合物中具有巨大的优势和开发潜力。本实验室前期从菌株Klebsiella sp.C2和Pseudomonas sp.C1中筛选获得了两种植物源蒜氨酸酶的细菌源同工酶胱硫醚裂解酶(KP和PP),具有高效催化合成系列硫代亚磺酸酯类化合物的活性。为系统解析新型蒜氨酸酶的催化性质,本研Secondary autoimmune disorders究在大肠杆菌中实现了酶的高表达并围绕其酶学性质展开研究,在此基础上对酶的热稳定性进行改造以及在生物安全菌株Saccharomyces cerevisiae中进行表达及发酵优化,主要取得了以下成果:一、将产酶菌株 Klebsiella sp.C2 和 sp.C1 中的酶 KP 及 PP在E.coli C43(DE3)中高效表达。将酶KP和PP在E.coli BL21(DE3)及E.coli C43(DE3)中表达,确定了酶的最佳诱导温度为16℃。通过对比酶在两个宿主中的表达情况,发现酶在E.coli C43(DE3)中表达效果要优于 E.coli BL21(DE3),E.coli C43(DE3)-pET24a(+)-kp/pp的表达均没有包涵体的产生,每升菌液可产酶活为26631.13±254.24 U及21588.46±232.12 U,分别为E.coli BL21(DE3)中表达量的 2.98 和 3.42 倍。二、测定了大肠杆菌E.coli C43(DE3)表达的KP和PP的酶学性质。对E.coli C43(DE3)表达的KP、PP的酶学性质进行测定,以L-(±)-蒜氨酸为底物,发现KP的最适反应温度为35℃,在0~35℃较为稳定,最适反应pH为9.0,在pH值为8.0~10.0较为稳定,对L-(±)-蒜氨酸的Km值为18.71±0.26 mM,Ks值为118.84±0.59/s,对S-甲基-L-半胱氨酸亚砜的Km值为35.95±0.28 mM,Ks值为106.21±0.34/s。PP的最适反应温度为55℃,在0~45℃较为稳定,最适反应pH为7.0,在pH值为7.0~9.0较为稳定,对L-(±)-蒜氨酸的Km值为7.82±0.14 mM,Ks值为55.80±0.28/s,对S-甲基-L-半胧氨酸亚砜的Km值为7.33 ±0.07 mM,Ks 值为63.48± 0.1 6/s。金属离子Ca2+及Mg2+对KP、PP具有明显的促进作用,Cu2+及selleckchem MG132SDS对KP、PP有显著抑制作用。对热稳定性较好的PP进行酶干粉喷雾干燥,计算酶活的回收率并评估酶干粉的稳定性。经过喷雾干燥后PP的质量回收率为57.80%,酶活回收率为52.28%,在4℃下长期保存,酶活几乎没有损失;在37℃下放置4个月酶干粉保留77.21%的酶活。三、较高催化活性的KP在酿酒酵母CEN.PK102-5B中实现异源表达,通过发酵培养基优化提高了 KP在酿酒酵母中的表达量。将PJFE3-P-K-Δ1Δ2-kp重组质粒在酿酒酵母CEN.PK102-5B中表达,以SD培养基作为初始培养基,经过单因子优化、Plackett-Burman实验设计以及中心复合响应面设计优化培养基,最终确定优化培养基配方为:糖蜜30.8 g/L,玉米浆干粉25.4g/L,酵母粉16.4 g/L,葡萄糖10.0g/L,磷酸二氢钾10.0g/L。与SD培养基相比,发酵罐酶活提高了 22.93%。四、较高热稳定性的PP进行易错PCR并进行高通量筛选,获得两个耐热性进一步提高的突变酶4-35-tbPP和6-41-tbPP。针对PP酶的热稳定性提高对其进行易错PCR突变,经过高通量筛选出4-35-tbPP、6-41-tbPP两个热稳定性提高的突变蛋白。其中4-35-tbPP最适反应温度为60℃,在0~55℃比较稳定,6-41-tbPP的最适反应温度为55℃,在0~65℃时较为稳定,热稳定性明显高于野生酶PP。4-35/6-41-tbPP的最适反应pH值为7.0,4-35-tbPP在pH值6.0~9.0 时较为稳定,6-41-tbPP在pH值7.0~9.0时较为稳定。4-35/6-41-tbPP 对 L-(±)-蒜氨酸的Km值分别为 8.48±0.39 mM、8.54 ±0.11 mM,Ks值为57.73±0.69/s、59.02±0.22/s,与 PP 相差不大。4-35/6-41-tbPP 在55℃的半衰期为40 h和43 h,分别是PP半衰期的1.60和1.72倍。测序发现4-35-tbPP的第389位氨基酸由赖氨酸突变为精氨酸;6-41-tbPP的第254位氨基酸由丙氨酸突变为苏氨酸,第284位氨基酸由谷氨酸突变为缬氨酸,氨基酸的改变增加突变酶的热稳定性。进一步对6-41-tbPP的突变氨基酸进行单点突变,发现第254氨基酸对酶的热稳定性提升有关键作用。

定点突变对决明Kunitz抑制剂抑制活性的影响

【目的】决明Kunitz胰蛋白酶抑制剂1(Cassia obtusifolia Kunitz trypsin inhibitor 1,CoTI1)是一类具有β-三叶草结构的功能多肽,探究定点突变对其抑制活性的影响,对CoTI1CX-5461生产商的结构研究具有重要意义。【方法】基于CoTI1结构分析,分别将位于顶部盖子β2和β3折叠之间的Cys44,以及位于底部β-桶β9折叠内的Tyr134和Lys135这3个位点的氨基酸残基突变为丙氨酸(Ala),将各突变体进行蛋白表达之后再检测其对牛胰蛋白酶和菜青虫类胰蛋白酶的抑制作用。【结果】与野生型CoTI1相比,CoTI1~(C44D)对牛胰蛋白酶的抑制活性升高41.00%,CoTI1~(Y134D)和CoTIselleckchem CP-4567731~(K135D)对牛胰蛋白酶的抑Airborne infection spread制活性分别下降45.66%和36.73%;CoTI1~(C44D)、CoTI1~(Y134D)和CoTI1~(K135D)对菜青虫类胰蛋白酶的抑制活性分别下降46.94%、49.00%和38.11%。【结论】Cys44、Tyr134和Lys135参与了β-三叶草结构的形成,是稳定CoTI1的空间结构及抑制活性的重要残基,为CoTI1的结构研究奠定了重要的理论基础。

辣蓼黄酮长循环纳米脂质体的制备

研究旨在优化辣蓼黄酮长循环纳米脂质体制备条件。试验首先以包封率为评价指标,筛选辣蓼黄酮长循环纳米脂质体制备方法。确定改良乙醇注入法后,采用单因素试验考察磷胆比、药脂比、生理盐水体积、超声时间、表面活性剂用量因素对包封率的影响;再通过Box-Behnken响应面法进行3因素3水平优化,选取磷胆比、药脂比、生MRTX849生产商理盐水体积等3个因素进一步优化;确定最佳的脂质体制备条件后,通过后插入法将DSPEMPEG 2000插入辣蓼黄酮Dolutegravir供应商纳米脂质体上,制成辣蓼黄酮长循环纳米脂质体并进行表征。结果显示,改良乙醇注入法制备辣蓼黄酮长循环纳米脂质体最优条件是:磷胆比(质量Auto-immune disease比) 6.8∶1、药脂比(质量比) 1∶10.3、生理盐水体积9.5 mL。选择摩尔比为5%的DSPE-MPEG 2000制备长循环纳米脂质体,在最优条件下制备的辣蓼黄酮长循环纳米脂质体平均包封率为(72.60±2.44)%,脂质体粒径为(80.93±0.30) nm,多分散性指数(PDI)为0.14±0.01,Zeta电位(-1.70±0.29) mV。

基于生物分子自组装的仿氧化酶催化体系的构建及应用研究

酶是经过数十亿年自然选择和优化而成的高效生物催化剂,通过催化多种多样的化学反应在生物体中发挥着重要作用。酶的折叠结构对环境的变化极其敏感,导致酶的催化性能容易受到外界条件变化的影响。因此天然酶实现高效的催化往往需要温和的反应条件,这通selleck NMR常不能满足工业转化的需求。同时,天然酶还有难以分离纯化、修饰工艺复杂等不足。研究者们为了扩大酶的应用范围发展了多样的酶工程技术,比如定向进化是调控酶功能的有效手段,但该方法仅限于酶蛋白中天然氨基酸种类的更换,无Electro-kinetic remediation法利用种类丰富的氨基酸变体或衍生物,且需要反复迭代而费时费力。基于酶本身固有的超分子属性,分子自组装作为一种自下而上构建特定结构材料的方法,具有操作方法简单、制备条件温和以及可设计性强等特点,为从头设计和制备具有酶催化功能的人工催化剂提供了一条新的途径。酶的更多活性位点是酶催化功能发挥的关键区域,如何在人工体系中模拟天然酶活性位点的几何结构和化学环境,获得催化性能能够匹敌甚至超越天然酶的催化体系,是一项有挑战性的研究课题。本论文受天然酶的活性中心结构和催化原理启发,通过生物分子自组装的方法设计并构建了三种仿氧化酶催化体系:(1)天然水解酶活性中心通常含有组氨酸残基,同时组氨酸也是多铜氧化酶(如漆酶)活性位点的关键残基,能够与辅因子铜配位并实现底物的高效转化。受到水解酶和多铜氧化酶活性中心结构的启发,本论文通过芴甲氧羰基(Fmoc)组氨酸衍生物与Cu~(2+)自组装制备了能够催化水解和氧化反应的双功能模拟酶。通过Fmoc基团的聚集,实现组氨酸咪唑基团的富集,获得了较高的催化水解活性;Cu~(2+)与Fmoc-组氨酸组装构建了具有类似漆酶多铜活性中心的氧化模拟酶,鸟嘌呤核苷酸(GMP)的加入进一步提升了催化氧化活性。模拟酶展现了催化水解-氧化(或氧化-水解)级联反应的能力,且具有良好的热稳定性,在分解芳香酯类污染物方面具有一定的应用潜力。进一步地,通过对组装基元中咪唑不同位置N的甲基修饰实现了对仿酶活性的调控;当N_δ位的H被甲基取代后,咪唑侧基的亲核能力增强以及与铜的配位-解离速度变快,使得模拟酶表现出较高的催化水解和氧化活性,而N_ε位的H被甲基取代后水解和氧化活性均明显下降,咪唑不同位置的N在催化过程中展现出异质性。该工作证实了分子自组装方法可以方便的利用两亲性氨基酸构筑级联的人工催化体系,并通过氨基酸的修饰实现对催化性质的调控。(2)基于酶-底物复合物的启发,本论文通过鸟嘌呤核苷自组装制备了负载核黄素的可光产H_2O_2的超分子凝胶状材料。鸟嘌呤核苷在K~+的辅助下通过氢键形成G四分体,进而π-π堆积成纤维,随后在交联剂的作用下形成超分子凝胶,并通过共价连接和堆积作用负载核黄素。核黄素作为光催化活性中心,鸟嘌呤核苷作为还原性底物,两者相互靠近,形成待激活的活性中心-底物复合物功能材料。在蓝光(460 nm)照射下,材料无需添加其他组分便可实现完整的催化氧化循环并释放H_2O_2,且具有优异的储存稳定性和耐热性能。光产H_2O_2的特点使得光照后的材料表现出良好的抗菌性能,同时材料具备生物安全性,有潜力成为一种无需实时光照的具有抗菌效果的伤口敷料。(3)基于辣根过氧化物酶(HRP)活性中心远端组氨酸残基在催化循环中的作用,本论文设计了富含组氨酸的多肽并与HRP共组装形成具有高催化活性的超分子复合物。组氨酸多肽能够自组装形成β-折叠结构并与HRP发生非共价相互作用改变HRP的构象,使得多肽提供的外源组氨酸可能接近血红素活性中心并加快血红素静息态和中间态的转换,从而加快酶的催化循环,使得HRP的催化速率最大提升接近3倍。同时,HRP/多肽复合物具有更好的稳定性,且组氨酸多肽表现出对其他血红素依赖酶的活性增强作用。高催化活性的HRP/多肽复合物应用于生物分子检测,能够有效提高检测灵敏度。本论文中基于天然酶启发的生物分子自组装的方法为调控酶功能、扩大酶的应用范围提供了一条简而有效的途径,为超分子化学和酶工程等领域建立了桥梁。以天然酶为灵感进行模拟酶催化体系的人工仿生设计,有助于人们理解酶的催化过程和生命的进化演变。

α7烟碱型乙酰胆碱受体在单核/巨噬细胞介导的炎症反应与极化调控中的作用

单核细胞和巨噬细胞在健康和疾病中均发挥Docetaxel NMR重要作用,是固有免疫的重要组Serum laboratory value biomarker成,在其介导的炎症反应中保护宿主、清除病原Enasidenib体和调节免疫平衡,可通过清除细胞碎片、异物及调节炎症和愈合过程等维持内环境稳定。根据微环境和细胞激活状态,巨噬细胞可通过改变不同表型影响疾病转归。近二十年人们对胆碱能抗炎通路(CAP)在炎症反应中的作用及机制研究越来越深入,尤其是该通路中的重要结构——α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR),其本质为神经免疫系统的配体门控离子通道,且在调控单核/巨噬细胞吞噬、趋化因子和细胞因子产生、细胞存活和极化等方面发挥重要作用,相关机制涉及NLRP3炎症小体,可作为多种炎症性疾病的潜在治疗靶点。本文综述α7nAChR在炎症和免疫介导的疾病中对单核/巨噬细胞功能调控和极化的作用。

负载塞来昔布纳米晶可溶微针的制备及其对骨关节炎大鼠的药效学研究

目的通过处方筛选制备出粒径均一,稳定的塞来昔布纳米晶;制备出针形较好,机械性能强的塞来昔布纳米晶可溶微针并建立评价体系;通过建立骨关节炎大鼠模型研究负载塞来昔布纳米晶可溶微针对骨关节炎的治疗效果,为骨关节炎的治疗提供新的思路与策略。方法通过反溶剂沉淀法制备塞来昔布纳米晶,优化处方和工艺;通过透射电镜观察纳米晶的形态;通过X射线衍射与差示热探讨纳米晶的晶型结构;通过体外溶出实验,研究将塞来昔布制备成纳米晶后的溶出率;通过体外细胞毒性实验,探讨纳米晶的安全性;通过Western Blot实验研究塞来昔布纳米晶的抗炎效果;通过两步制针法制备塞来昔布纳米晶可溶微针,对其形态、机械性能、溶蚀性能、载药量等进行考察,探讨可溶微针包载CXB-NCs的可行性;建立ACLT骨关节炎大鼠模型,通过对骨关节炎大鼠的膝关节宽度、炎性因子的水平、膝关节的Micro-CT、膝关节的HE染色与免疫组化的结果分析,探讨CXB-NC@DMNs对骨关节大鼠的治疗效果;通过药代动力学实验,研究不同给药方式的大鼠的血液中药物的浓度。结果经过处方筛选确定反溶剂沉淀法制备CXB-NCs,最终制备得TGF-beta/Smad抑制剂到的CXB-NCs通过透射电镜结果显示为棒状结构;通过马尔文粒径emerging Alzheimer’s disease pathology仪测定的粒径为70.2±2.6 nm,多分散性系数(PDI)为0.163±0.062,粒径均一,且制备纳米晶的处方稳定;通过傅里叶红外光谱图可知,将CXB制备成CXB-NCs,CXB的化学结构不会发生改变;通过X射线衍射与差示热的结果可知,将CXB制备成CXB-NCs后,晶型结构不变,晶型变小;通过体外溶出实验可知,与CXB相比,CXB-NCs的溶出率显著增加,说明将CXB制备为纳米晶后,通过减小粒径能够增加其溶出率;通过细胞毒性实验,经CXB-NCs处理的正常的软骨细胞,细胞生存率在90%以上,说明CXB-NCs的生物相容性好。通过两步制针法制备CXB-NC@DMNs,以HA为针部溶液的辅料,以PVP K90为可溶微针基层辅料;通过光学显微镜观察,所制备的可溶微针针形完整;通过将CXB-NC@DMNs复溶并通过透射电镜观察复溶后CXB-NCs的状态,结果显示CXB-NCs仍然是棒状结构,说明将CXB-NCs包载于微针中不会改变其形态;通过对CXB-NC@DMNs的评价,机械性能较好并能很好的插入皮肤,在大鼠体内15 min,微针针部基本完全溶解;体外细胞毒性实验结果显示,微针辅料对正常细胞无毒性,生物相容性好;通过体外释放实验,表明CXB-NC@DMNs可以安全有效的递送药物,为骨关节炎大鼠的治疗提供了基础。ACLT骨关节炎大鼠实验结果表明,VX-661细胞培养CXB-NC@DMNs可以显著减少膝关节宽度,减轻炎症反应,抑制滑膜增生,逆转软骨组织的破坏,对骨关节炎大鼠的治疗有很好的效果。药代动力学结果显示,将CXB制备成纳米晶后,CXB-NCs的AUC_(0-t)是CXB原料药的三倍,说明纳米晶能够显著提高CXB的生物利用度。将CXB-NCs包载于DMNs中,CXB-NC@DMNs组的C_(max)为81.3±51.6 ng/m L,AUC_(0-t)为1035.5±677.2 h·ng/m L。表明,DMNs可以经皮肤将药物递送进入全身血液循环,且具有延迟药物释放的作用。此外,体内药效最好的CXB-NC@DMNs组的血药浓度显著低于两倍药量的纳米晶组,说明可溶微针组并非通过直接提高血药浓度来增加药物治疗效果,由此推测,可溶微针递药系统还可能通过其他途径增加病灶部位的药物浓度,增加治疗效果。

利用小RNA深度测序技术鉴定西瓜病毒病病原

西瓜是一种重要的园艺植物,近年来饱受病毒病危害。为明确西瓜病毒病害病原,对采自山西太谷区表现花叶、皱缩等症状的西瓜叶片进行小RNA深度测序,同时利用RT-PCR的方法并结合生物信息学的手段,综合分析造成西瓜花叶、皱缩症状的病毒病原。结果表明,表现皱缩、花叶症状的西瓜样品被瓜类蚜传黄化病毒(cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)、甜瓜潜隐病毒(cucumis melo cryptic virus,CmCV)、西瓜病毒A(watermelon virus A,WVA)、西瓜皱叶病毒2号(watermelon crinkle leaf-associated virus2,WCLaV2)和黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)5种病毒复合侵染。利用RT-PCR的方法分别扩增获得5种病毒的外壳蛋白(coat protein, cp)基因序列,进一步通过序列相似性分析和系统进化分析发现,本研究获得的西瓜CABYV分离物CABYV-SXJZ(GeneBank登录号:OP957280)核苷酸序列与中国南瓜CABYV分离物InnerMongolia(GeneBIACS-10759抑制剂ank登录号:EU262627)的核苷酸序列相似性最高,达到100%;西瓜WVA分离物WVA-SXJZ(GeneBank登录号:OP957281)核苷酸序列与同样来自中国瓠瓜WVA分离物WVA-Huizhou(GeneBank登录号:MK292710)和西瓜WVA分离物WVA-KF15(GeneBank登录号:KY363796)核苷酸序列相似性最高,分FG-4592浓度别达到93.6%%和99.9%;WCLaV2分离物WCLaV2-SXJZ(GeneBank登录号:OP957282)核苷酸序列与WCLaV2巴西西瓜分离物Ju-01(GeneBank登录号:LC636075)核苷酸序列相似性性最高,达到99.6%;本研究首次从西瓜上获得的CmCV分离物CmCV-SXJZ(GeneBank登录号:OP957283)核苷酸序列与中国甜瓜分离物CmCV-HLJ(GeneBank登录号:MH479773)的核苷酸相似性高达99.9%;本研究获得的CGMMV分离物CGMMV-SXJZ(GeneBank登录号:OP957284)核苷酸序列与CGMMV分离物GDLZ(GeneBank登录号:MK933286)、CG038(GeneBank登录号:MH271443)、CGMMV-pXT1(GeneBank登录号:KY753929)、e WT(GeneBank登录号:KY753928)、C284R(GeneBank登录号:KY753927)、CGMMV-XG(GeneBank登录号:KP868654)、JD2(GeneBank登录号:KM873785)和Anhui(GeneBank登录号:KTprotamine nanomedicine236095)核苷酸序列相似性最高,均达到99.8%。

丹皮酚对雷西莫特诱导的巨噬细胞M1极化的影响

目的 观察丹皮酚是否能够影响巨噬细胞M1极化。方法 用Toll样受体7/8激动药雷西莫特(R848)刺激RAW264.7细胞建立M1型巨噬细胞模型。将细胞分为对照组、模型组、高剂量实验组。对照组细胞正常培养;模型组用2μg·mL~(-1)的R848处理24 h,高剂量实验组用2μg·mL~(-1)R848和30μmol·L~Recipient-derived Immune Effector Cells(-1)丹皮酚处理24 h。以酶联免疫吸附(ELISA)法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分泌水平;以流式细胞术检测CD80阳性表达的巨噬细胞比例;以实时荧光定量多聚核苷酸链反应(Q-PCR)检测TNF-α、白细胞介素-1β(IL-1β)mRNA的表达水平;以蛋白质印迹法检测iNOS蛋白表达情况。结果 高剂量丹皮酚干预R848诱导的M1极化24 h后,对照组、模型组和高剂量实验组上清中TNF-α水平分别为(355.55±16.45)、(552.69±18.09)和(447.71±22.71)ng·L~(-1);CD80阳性细胞比例分别为(16.29±0.50)%、(43.57±3.78)%和(36.08±1.40)%;IL-1β mRNA表达水平分别为1.04±0.15、60.02±12.92和34.69±1.75;TNF-α mRNA表达水平分别为1.00±0.04、13.69±0.25和12.20±0.46;iNOS蛋白表达水平分别为1.00±0.00、1.11±0.05和0.91±0.0Decitabine供应商3。模型组上述指标与对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05);高剂量实验组上述指标与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 丹皮更多酚能够抑制R848诱导的巨噬细胞M1极化。

骨形态发生蛋白和依诺沙星功能化介孔二氧化硅纳米颗粒用于感染下骨修复相关研究

研究背景及目的骨折固定及假体植入已广泛应用于骨科植入物手术中,但因其无法抵抗微生物感染,而导致植入物相关感染的发生。我军海外基地、舰艇编队在执行远海作战任务时,大多数外伤伤部集中在四肢骨盆,伤员后送难度大,精确手术开展非常困难,由于远海作战伤员得不到及时有效的救治、后送困难,致残致死率高,严重影响作战和演训任务的顺利进行,并给伤员的伤后生活带来巨大的痛苦。对于四肢骨盆骨折,一期以外支架螺钉临时稳定骨折后修复软组织、二期更换髓内钉或锁定钢板的分Vorinostat浓度期治疗策略已被人们广泛接受。但外固定螺钉钉道感染和螺钉松动对二次手术转换时机以及外支架治疗的时限有很大影响。加上前线医疗条件差、设备简陋,战场恶劣环境也导致伤口极其易受感染。与骨科植入物相关的感染引起的过度炎症反应、进行性骨溶解和持续的细菌负荷,抑制了感染时的骨愈合。传统全身输注抗菌药物抗感染治疗可导致耐药性且副作用大,同时并不能抑制骨吸收和调节巨噬细胞炎症反应。为了改善细菌感染时的骨愈合,理想的治疗方法不仅要在局部清除细菌,还要促进骨修复、抑制炎症和骨溶解。因此,研制出一种具有抗感染、促进骨修复并抑制骨溶解和炎症的多功能生物材料,对骨科临床及我军一线战伤抗感染救治有重要的意义。近些年,通过对骨科植入物表面纳米结构改性或应用纳米载体来运送抗菌药物到给感染部位来增强局部抗菌效果越来越引起各国学者的关注。介孔二氧化硅纳米颗粒因其可控的孔径、高表面积、可调节的表面功能化、优良的化学稳定性和孔隙性质,成为生物医学等多领域的研究热点。本研究的目的是通过共价固定骨形态发生蛋白4的介孔二氧化硅纳米颗粒并负载依诺沙星来制备一种多功能纳米载药颗粒,具有良好的生物相容性和缓释药物的功能,用于局部抗菌、抑制炎症和骨溶解。同时,通过体内、外实验验证骨形态发生蛋白4/依诺沙星修饰介孔二氧化硅纳米颗粒的抗菌性能、抑制炎症和骨溶解能力。研究方法利用ABT-199溶胶-凝胶法制备介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs),并在氨化的介孔二氧化硅纳米颗粒表面共价接枝骨形态发生蛋白4(BMP4)以及在介孔二氧化硅纳米颗粒孔隙中负载依诺沙星(EN)。随后应用扫描电子显微镜(SEM)以及透射电子显微镜(TEM)观察涂层表面结构。所有样品通过超声分散在无水乙醇中后,使用纳米粒度分析仪测量纳米颗粒的分散性。通过药物释放实验研究介孔二氧化硅/骨形态发生蛋白4/依诺沙星纳米颗粒(MSNs-BMP4-EN)药物释放能力。通过体外抑菌实验测定MSNs-BMP4-EN纳米颗粒最低抑菌浓度(MIC)并记录其对金黄色葡萄球菌的生长曲线,并利用细菌活性实验、细菌涂板定量实验和活/死细菌染色实验来评估MSNs-BMP4-EN的体外抗菌性能。通过体外细胞毒性实验(CCK-8法)来探究纳米颗粒对大鼠骨髓间充质干细胞(r BMSCs)增殖的影响。通过碱性磷酸酶(ALP)染色及定量实验、胶原染色及定量实验、茜素红(ARS)染色及定量实验以及大鼠的成骨分化标志物基因RNA定量分析、蛋白质印迹分析,研究MSNs-BMP4-EN对r BMSCs成骨分化的影响。利用抗酒石酸磷酸酶(TRAP)染色、破骨相关标志物基因RNdrug-resistant tuberculosis infectionA定量分析和骨吸收实验,评估MSNs-BMP4-EN对破骨分化的影响。利用Sanger测序、酶联免疫吸附试验(ELISA)炎症相关标志物基因RNA定量分析,评估MSNs-BMP4-EN对感染状态下局部炎症免疫的影响。通过构建大鼠股骨骨缺损模型,进行体内抗感染实验及体内成骨实验,利用micro-CT分析、微生物学分析、组织切片和Van Gieson染色等多种实验方法评估MSNs-BMP4-EN在体内的抗感染、成骨能力。研究结果利用SEM和TEM对纳米颗粒进行了分析,证实了成功合成了所需的MSNsBMP4-EN纳米复合材料,其呈粒径约50 nm的均匀球形、表面有许多均匀分布的孔洞。粒径分析仪显示三种纳米粒子在无水乙醇中分别形成直径分别为210.7 nm、220.7 nm和187.4 nm的粒子团。依诺沙星在吸光度286nm处有一个特征峰,浓度与吸光度呈良好的线性关系。其包封率和载药量分别为43.25%和30.10%。药物释放实验显示MSNs-BMP4-EN纳米颗粒具有较高的药物释放率,在12小时内爆发释放依诺沙星后可持续缓释5天。在第5天时依诺沙星的累积释放率为67.4%。体外抑菌实验证实,MSNs-BMP4-EN可显著抑制金黄色葡萄球菌的黏附和增殖。体外细胞毒性实验和成骨分化相关实验表明,MSNs-BMP4-EN可促进r BMSCs增殖及早期、晚期成骨分化。体外破骨分化相关实验表明,MSNs-BMP4-EN可阻止早期破骨细胞的形成、抑制骨溶解。体外炎症相关实验表明,MSNs-BMP4-EN可抑制小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)分泌炎症因子,从而改变免疫微环境,有利于成骨分化和细胞外基质矿化。动物体内实验表明,MSNs-BMP4-EN可有效抑制金黄色葡萄球菌感染并抑制感染时的巨噬细胞炎症反应和细菌导致的骨溶解,最终促进骨感染条件下的骨愈合。研究结论MSNs-BMP4-EN纳米复合材料具有制备方法简单、成本低、高载药量、较久的缓释性能及良好的生物相容性等优点。这些实验表明MSNs-BMP4-EN具有优良的抗菌和抗炎特性,并能在植入物感染的早期阶段抑制骨吸收,从而进一步促进骨愈合。因此,这种具有多种生物功能的纳米复合材料在治疗骨感染方面具有良好的临床应用前景,未来有望转化为临床骨科植入物涂层或手术部位植入药物,并对我军一线战伤抗感染救治有重要的意义。