叶片作为光合作用的功能器官,对植物的生长发育至关重要,影响叶菜的产量和风味品质。芥蓝属于中国特产的十字花科芸Emricasan溶解度薹属甘蓝类蔬菜,其食用部位为肥嫩的菜薹和嫩叶。然而,在芥蓝生长过程中叶片发育及形态建成的转录调控机制仍然知之甚少,因而研究芥蓝叶片发育及形态建成的分子机制具有重要意义。本文以‘香菇’芥蓝(Brassica oleracea cv.‘Xiang Gu’)为实验材料,首先结合叶片转录组分析代谢通路的差异表达基因,然后选择关键基因进行生物信息学分析。其次针对关键成员进行启动子载体、基因过表达载体及基因敲除载体的构建等功能验证实验,接着对关键基因的潜在上下游调控通路进行酵母单杂交和蛋白互作等验证实验。最后观测转基因植株表型变化及相关基因表达情况,从表观遗传学和分子生物学上阐明关键基因在叶片发育过程中的作用机制。主要研究结果包括以下四个方面:1基于转录组测序分析芥蓝叶片发育过程中代谢通路差异表达基因为了探究‘香菇’芥蓝(XG)叶片发育及变态叶形态建成的主要影响因素,针对‘香菇’芥蓝叶片生长发育共12个样品测序分析。发现4个比较组DE-m RNAs的KEGG主要富集在植物激素信号转导通路。基于WGCNA及Cytoscape基因共表达网格分析,发现植物激素信号传导关键基因主要与RNA结合、细胞分裂素、赤霉素、生长素和TCP蛋白结构域相关。2芥蓝BoTCP家族全基因组鉴定及表达分析为明确芥蓝TCP家族相关基因在叶片发育中的功能,本研究基于甘蓝基因组数据,分析鉴定出芥蓝TCP基因家族有40个成员,参考拟南芥同源TCP基因注释及拟南芥数据库基因的相对表达量,初步选取BoTCP21和BoTCP25基因,采用q RT-PCR分析。结果表明:BoTCP21和BoTCP25均在叶片中大量表达,但二者在真叶不同部位的表达模式存在差异。为了进一明确TCP基因家族中参与叶片发育的基因,采用生物信息学方法并结合q RT-PCR对BoTCP家族进行了全面分析。结果显示:40个BoTCP都属于非分泌亲水性蛋白,分别定位在8条染色体上;系统进化树构建和亲缘关系分析将芥蓝中的BoBiomedical ResearchTCP成员归为三类,其中PCF亚家族有19个成员,CYC亚家族8个,CIN亚家族13个。q RT-PCR结果表明:BoTCP21和BoTCP25在真叶和薹叶中具有较高的表达量,BoTCP14在开花结荚的植株根部表达量较高,而BoTCP16则在抽薹植株的根部表达量最高,说明BoTCP家族成员在组织部位表达存在时空特异性且广泛参与了植株的形态建成和器官发育。3 BoTCP25在芥蓝叶片发育调控中的功能在前期的研究中,我们已经鉴定了BoTCP25在芥蓝叶片中的高表达。为了了解BoTCP25在叶片中的功能,我们克隆了BoTCP25并构建了相关的载体。亚细胞定位分析表明,BoTCP25定位于细胞核内,而对BoTCP25启动子转化的拟南芥植株的GUS染色表明,BoTCP25在整个生长过程中广泛表达。我们还获得了过表达的BoTCP25转基因拟南芥和芥蓝植株,表型分析显示,异源过表达TCP25促进了拟南芥叶片数量和叶面积的增加,而过表达TCP25则影响了芥蓝变态叶的位置和数量,同时导致幼叶向下卷曲。酵母单杂交实验证实BoTCP25可以与BoNGA3的启动子结合。此外,pre-mi R319的表GW-572016采购达模式与BoTCP25和BoNGA3的表达模式相反,暗示它们可能形成一个mi R319a-BoTCP25-BoNGA3模块,共同参与芥蓝叶片发育及形态建成的调控。此外,BoTCP25的表达响应激素元件,如乙烯和生长素。综上所述,我们的研究表明,mi R319a-BoTCP25-BoNGA3模块在植物叶片发育和形态建成中起着重要作用。4突变体tcp16和mir319a在芥蓝的功能分析前期通过生物信息学分析,发现BoTCP16和BoTCP25与mi R319a存在靶向调控关系且蛋白预测分析BoTCP蛋白与BoARF4蛋白可能存在互作关系。通过构建相关敲除载体并转化拟南芥和‘香菇’芥蓝,我们发现拟南芥tcp16突变体植株变小叶片数量减少且不存在主薹,相反mir319a突变体植株叶片增多而抽薹时间延迟;同时对突变体tcp16‘香菇’芥蓝植株表型观测,发现突变体植株叶片及变态叶数量减少,同时株型矮化表现为植株株高、株幅和节间长度均显著降低。q RT-PCR分析表明BoTCP16在突变体叶片部位的表达均下调,这与BoTCP25和BoARF4表达模式相似。通过双分子荧光互补证实了BoTCP16蛋白与BoARF4蛋白存在互作关系,外源添加生长素抑制剂NPA表明生长素对叶片发育及变态叶的诱导至关重要。综上所述,tcp16突变体在拟南芥和‘香菇’芥蓝植株有相似的功能,BoTCP16受到mi R319的负调控,同时可能受到生长素的直接调节,此外BoTCP16与生长素响应因子BoARF4蛋白存在互作关系。以上结果说明Bomi R319-BoTCP16/BoARF4模块通过调节植株体内激素含量的分布,从而共同参与对叶片发育的调控,进而影响植株株型。