目的:砷是一种常见的有毒类金属元素,广泛存在于自然界中,长期暴露于砷会导致机体多器官损伤,肾脏作为砷的主要排泄器官,当其受损时可影响体内砷及其代谢产物的排泄,促进砷在体内的蓄积,导致包括肾脏在内的多器官受损。但是砷引起肾损伤的机制目前尚不清晰,因此,本研究首先利用贵州省特有的燃煤型砷中毒病型资源,从人群角度了解砷对人群肾脏的影响。进一步建立砷中毒大鼠肾损伤模型,探讨C/EBPβ-TFAM介导的炎症反应在砷致大鼠肾损伤中的作用;除致病机制不清外,砷中毒防治面临的另一大主要问题是缺乏特效治疗药物,基于上述机制研究的发现,进一步探讨刺梨汁对砷致肾损伤的干预作用。目前地方性砷中毒诊断标准是依据皮肤损伤程度进行判定,课题组前期进行的病区现场流行病学研究发现地砷病患者有合并肝肾损害现象,砷暴露者在出现明显可见皮肤损伤之前可能就已经出现肝肾损害,因此为保护病区非明确诊断的病人,设计两组大鼠干预模型,包括拮抗模型及治疗模型,探讨刺梨汁对砷引起肾损伤的预防及治疗作用,为将来砷暴露患者的健康损害的预防及治疗提供参考依据。方法:1.调查点及调查对象的选择:以贵州兴仁县雨樟镇为调查点,根据《砷中毒诊断标准》(WS/T211-2015),在砷中毒病区村交乐村确定205名砷中毒患者为病例组;在非砷暴露村上坝田村经健康体检选择150名与交乐村居民生活习惯和经济条件相近,且无燃用高砷煤史的居民作为对照组。进一步根据砷中毒症状的严重程度将砷中毒患者分为轻度砷中毒组(80例)中度砷中毒组(77例)和重度砷中毒组(48例)。采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定尿砷含量;全自动生化分析仪检测血清肌酐(Serum creatinine,SCr);ELISA法检测尿液肾损伤分子1(Kidney injury molecule 1,KIM-1)及中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Neutrophil gelatinase associated lipocalin,NGAL)。2.砷中毒大鼠模型建立:选择GSI-IX供应商24只清洁级Wistar大鼠,适应性喂养一周后,按随机数字表法将其分为正常对照组,低砷剂量组,中砷剂量组及高砷剂量组4组,每组6只,雌雄各半,对照组给予去离子水灌胃,染毒组分别给予2.5(1/16LD_(50))、5(1/8LD_(50))、10(1/4LD_(50))mg/kg·bw的亚砷酸钠(Na As O_2)水溶液灌胃染毒,每天1次,每周6天,持续四个月。实验终期采集生物样本,苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin staining,HE)染色法观察大鼠肾脏形态结构改变;采用免疫印迹(Western Blot,WB)检测大鼠肾脏组织中NGAL、CCAAT/增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancer binding protein beta,C/EBPβ)、线粒体转录因子A(Mitochondrial transcription factor A,TFAM)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)相关蛋白(NLRP3、ASC、caspase-1)及其下游炎性因子(IL-1β、IL-18)蛋白表达;免疫组化(Immunocytochemistry,IHC)染色观察大鼠肾脏组织中相关蛋白定位和表达情况。3.刺梨汁干预砷中毒大鼠模型建立:3.1刺梨汁拮抗大鼠模型:选择24只清洁级Wistar大鼠,适应性喂养一周后,按随机数字法分为正常对照A组、高砷剂量组、刺梨对照组及刺梨汁拮抗组4组,每组6只,正常对照A组同第一部分正常对照组;高砷剂量组同第一部分高砷剂量组;刺梨对照组给予10m L/kg·bw刺梨汁,每天1次,每周6填,灌胃4个月;刺梨汁拮抗组给予10mg/kg·bw亚砷酸钠水溶液灌胃的同时给予10m L/kg·bw刺梨汁灌胃连续4个月。3.2刺梨汁治疗大鼠模型:选择18只清洁级Wistar大鼠,适应性喂养一周后,按随机数字法分为正常对照B组、砷中毒自然恢复组以及刺梨汁治疗组3组,每组6只,正常对照B组给予去离子水灌胃5.5个月,每天1次,每周6天;砷中毒自然恢复组给予10mg/kg·bw亚砷酸钠水溶液灌胃4个月后给予去离子水灌胃1.5个月;刺梨汁治疗组给予10mg/kg·bw亚砷酸钠水溶液灌胃4个月后给予10m L/kg·bw刺梨汁灌胃1.5个月)。指标检测同2。4.刺梨汁对砷中毒患者肾损伤的干预效果观察:利用课题组前期对砷中毒患者干预研究的样本资源进行效果观察,调查点为贵州兴仁县交乐村。简要干预方法如下:在通过学校伦理学审查及与患者签订知情同意书基础上,最终确定符合纳入排除标准、依从性好并全程参与干预的46例砷中毒患者作为干预对象,给予刺梨汁口服干预,每日20 m L,每天早餐后服用一次,持续90天。全自动生化分析仪检测血清肌酐(SCr);ELISA法检测尿液肾损伤分子1(KIM-1)及中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)。5.统计学方法:采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析,首先进行正态性检验,样本呈正态分布时,数据以(?)±s表示,组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较方差齐采用Bonferroni检验,方差不齐则采用Tamhane’s T2检验;样本呈非正态分布时,数据采用中位数(四分位间距)表示,采用非参数检验进行组间比较,相关性分析使用Pearson相关系数进行分析,P<0.05时差异具有统计学意义。结果:1.砷对肾功能的影响及其机制初探:1.1砷对人群肾功能的影响:为了解砷中毒病区居民肾损伤现况,本研究纳入205例病区患者以及150例对照人群,并对其尿砷浓度进行检测,结果显示,砷中毒人群尿砷浓度显著高于对照组,肾功能指标检测结果显示砷中毒人群尿NGAL(6.73μg/m L)、KIM-1(297.32 pg/m L)及SCr(0.80 mg/d L)浓度显著高于对照组(6.38μg/m L、280.93 pg/m L、0.72 mg/d L),e GFR(94.49m L/min/1.73m~2)显著低于对照组(99.31 m L/min/1.73m~2)。相关性分析结果显示,随着尿砷浓度增加,尿NGAL及SCr浓度显著升高,e GFR与UAs呈显著负相关。1.2亚砷酸钠暴露致大鼠肾损伤作用机制初探:在第一部分研究发现砷暴露导致人群肾功能下降基础上,针对其机制不清问题,建立砷暴露大鼠模型,初步探讨砷致肾损伤的作用机制,结果发现:(1)与对照组相比,砷暴露组大鼠肾脏组织中NGAL表达增加,肾脏组织结构完整性被破坏,出现不同程度的肾小球空泡样变、肾小管扩张及炎性细胞浸润;(2)炎症反应在砷致肾损伤中发挥重要作用:中砷剂量组与对照组相比,IL-1β及IL-18的蛋白表达水平显著升高(P<0.05),高砷剂量组与对照组相比,IL-1β及IL-18蛋白表达无显著差异;免疫组化结果显示,与对照组相比,高砷剂量组及中砷剂量组IL-1β及IL-18在肾小管上皮细胞中表达明显增强(P<0.05)。(3)亚砷酸钠上调C/EBPβ和TFAM表达,激活NLRP3炎症小体:高砷剂量组大鼠肾脏组织中NLRP3炎症小体相关蛋白表达显著高于对照组(P<0.05),与对照组相比,高砷剂量组大鼠肾脏组织中C/EBPβ和TFAM蛋白表达显著升高(P<0.05)。免疫组化结果显示,与对照组相比,各染砷剂量组NLRP3和caspase-1在肾小管上皮细胞中表达明显增强,C/EBPβ和TFAM蛋白表达显著升高,且随着染砷剂量的增加其表达水平逐渐升高(P<0.05)。2.刺梨汁对砷致肾损伤的干预作用:2.1刺梨汁对砷致大鼠肾损伤的干预作用:基于上述机制初探发现砷可能通过促进C/EBPβ和TFAM表达,激活NLRP3炎症小体,引发炎症反应,诱导肾脏损伤,本部分针对性选择具有抗炎作用的刺梨汁进行干预,结果发现:(1)刺梨汁对砷暴露大鼠肾损伤的拮抗作用:与高砷剂量组相比,刺梨汁拮抗组大鼠肾脏组织肾小球空泡样变、肾小管扩张及炎性细胞浸润程度有所缓解,与对照A组比较,高hepatic endothelium砷剂量组大鼠肾脏组织中NGAL表达明显增高,与高砷剂量组比较,单纯刺梨汁组与刺梨汁拮抗组大鼠肾脏组织中NGAL表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与高砷剂量组相比,刺梨汁拮抗组大鼠肾脏组织中C/EBPβ、TFAM、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β及IL-18的表达显著减低,差异具有统计学意义。免疫组化结果显示,与高砷剂量组相比,单纯刺梨汁组及刺梨汁拮抗组大鼠肾脏组织中NLRP3与caspase-1表达情况显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)刺梨汁对砷暴露大鼠肾损伤的治疗作用:HE染色结果显示,与砷中毒自然恢复组相比,刺梨汁治疗组大鼠肾脏组织中肾小管扩张及炎性细胞浸润程度有所缓解。与对照B组相比,砷中毒自然恢复组大鼠肾脏组织中NGAL表达显著升高,与砷中毒自然恢复组相比,刺梨汁治疗组大鼠肾脏组织中NGAL表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与砷中毒自然恢复组相比,刺梨汁治疗组大鼠肾脏组织中C/EBPβ、TFAM、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β及IL-18的表达显著减低,差异具有统计学意义。免疫组化结果显示,与刺梨汁治疗组大鼠肾脏组织中NLRP3与caspase-1含量显著低于砷中毒自然恢复组,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.2刺梨汁对砷中毒患者肾损伤的干预效果观察:基于上述研究发现刺梨汁可减轻砷中毒大鼠肾脏炎症反应,改善砷引起的肾脏病理改变,缓解肾损伤,本部分基于刺梨汁作为具有丰富营养成分的天然膳食补充剂,为推进刺梨汁在人群中应用,利用课题组砷中毒干预人群标本,检测肾损伤相关指标,观察刺梨汁干预效果,结果发现:与干预前相比,干预后砷中毒患者尿液KIM-1(252.27 pg/m L)及NGAL(4.99μg/m L)浓度显著低于干预前(404.9 pg/m L、6.52μg/m L),SCr(0.62 mg/d L)浓度显著低于干预前(0.68 mg/d L),e GFR(123.04 m L/min/1.73m~2)水平显著升高(P<0.05)。结论:1.砷暴露可引起人群SCr升高,e GFR降低,肾功能损伤早期标志物尿NGAL、KIM-1增加,引起肾功能下降,尿砷浓度升高是人群肾功能下降的危险因素。购买PEG3002.砷暴露可能通过上调C/EBPβ、TFAM表达,激活NLRP3炎症小体,促进炎性因子IL-18及IL-1β释放,引发炎症反应,导致肾脏损伤;3.刺梨汁可以改善砷引起的大鼠肾脏组织结构病变,在预防和治疗砷引起的肾损伤方面具有一定作用,其机制可能与C/EBPβ-TFAM介导的炎症反应有关;4.刺梨汁可以降低砷中毒患者的SCr以及尿KIM-1、NGAL浓度,提高e GFR,改善其肾功能。