目的:本研究旨在探讨妊娠期慢性应激(CPS)子代小鼠杏仁核形态结构和抑郁样行为的变化,以及CRHR1是否介导CPS所致的杏仁核病理改变和抑郁样行为及其作用机制。方法:1.建立CPS模型,探究子代小鼠抑郁样行为和杏仁核形态结构的变化及部分相关机制:采用C57BL/6J小鼠,雌雄比例为2:1合笼,将孕鼠随机分为正常组和慢性应激组,慢性应激组孕鼠在妊娠期第7-20天实施慢性不可预测性应激方案,正常组孕鼠不受任何干扰。孕鼠分娩当天为出生后第0天(PND 0),仔鼠在PND 21与母鼠分离,分为:正常对照组(CON)、母代妊娠期慢性应激组(CPS),并将CON组和CPS组一步分成雌性组(Female)、雄性组(Male),雌雄分笼饲养。在PND 36开始,仔鼠抑郁样行为指标通过一系列行为学试验测试,包括糖水偏好试验(SPT)、旷场试验(OFT)、强迫游泳试验(FST)。随后采用Golgi-Cox染色法观察基底外侧杏仁核(BLA)神经元形态和树突棘密度来评估BLA的神经可塑性,采用TUNEL法检测BLA区域的细胞凋亡情况。通过Western blot技术检测杏仁核mTORC1信号的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和磷酸化mTOR[p-mTOR(Ser2448)]表达水平,探究CPS对杏仁核mTOR信号活性是否产生影响。通过ELISA检测仔鼠血清促肾上腺激素释放激素(CRH)含量。2.构建CPS子代杏仁核CRHR1基因条件性敲除小鼠模型,探究CRHR1介导CPS致子代小鼠杏仁核病理改变和抑郁样行为的相关机制:C57BL/6J背景的loxP小鼠和Cre小鼠通过Cre/loxP系统繁育获得杏仁核CRHR1基因条件性敲除的子代小鼠。妊娠期应激组孕鼠在妊娠期第7-20天实施CPS方案(同上)。仔鼠在PND 21与母鼠分离,并将雌雄分笼饲养,根据基因鉴定结果和母亲妊娠期是否经历慢性应激将仔鼠分为:野生型加正常对照组(WT+CON)、CRHR1基因敲除纯合子加正常对照组(CRHR1~(loxP+/+)Prok2-Cre+CON)、野生型COVID-19 infected mothers加妊娠期慢性应激组(WT+CPS)、CRHR1基因敲除纯合子加妊娠期慢性应激组(CRHR1~(loxP+/+)Prok2-Cre+CPS)。仔鼠在PND 21与母鼠分离,将雌雄分笼饲养。仔鼠在PND 36开始行为学试验。通过急性应激试验,ELISA检测血清皮质酮(CORT)水平来评估仔鼠HPA轴反应活性。通过Golgi-Cox染色法观测基底外侧杏仁核(BLA)神经元形态结构,采用TUNEL法检测BLA区域的神经元凋亡情况。通过Western blot技术检测杏仁核中mTORC1及其上游调控信号Akt和下游作用底物p70S6K相关蛋白以及突触相关蛋白PSD-95、synaptophysin(SYP)表达水平。采用RT-q PCR技术来检测杏仁核中CRHR1、PSD-95、SYP的mRNA水平。结果:1.CPS对子代小鼠抑郁样行为和杏仁核神经元形态结构以及血清CRH水平的影响:子代行为学测试结果显示,CPS导致雌鼠糖水偏好降低,雌雄小鼠漂浮不动时间增加,旷场中央区域探索时间和站立次数均减少,且雌雄在不同行为学指标上表现出性别差异性。为了评估杏仁核的神经可塑性,我们观测了仔鼠基底外侧杏仁核BLA锥体神经元形态,高尔基染色发现,CPS降低了雌雄小鼠的树突分支复杂性,树突分支同心圆交点总数减少。此外实验还观察到,雌鼠Rapamycin作用CPS组的树突棘密度相较于正常组明显降低。tunel法细胞凋亡检测发现,CPS明显提高了仔鼠的BLA神经元凋亡指数。WB实验检测了杏仁核mTOR信号,结果显示,相较于正常组,雌雄CPS组的磷酸化mTOR表达水平均显著降低。此外ELISA实验发现,CPS导致了子代小鼠的血清CRH水平明显升selleckchem VX-445高。2.杏仁核CRHR1缺陷对CPS引起的小鼠抑郁样行为和杏仁核形态结构变化的影响,以及杏仁核CRHR1缺陷对Akt-mTORC1信号通路的影响:本课题成功构建CPS子代杏仁核CRHR1基因条件性敲除小鼠模型。子代杏仁核CRHR1基因转录情况的检测结果显示,相较于野生型,CRHR1条件性基因敲除鼠的杏仁核CRHR1 mRNA水平明显降低,该模型小鼠表现出杏仁核CRHR1基因缺陷。急性应激实验结果发现,在急性应激前各组小鼠的基础血清皮质酮水平无差异,在急性应激90 min后野生型的CPS组较正常组,血清皮质酮仍处于较高水平,而基因缺陷小鼠的CPS组血清皮质酮已恢复至同正常组相似的水平。行为学测试结果显示,CPS对基因缺陷小鼠的各项行为指标无明显影响,且基因缺陷小鼠的CPS组相较于野生型CPS组各项行为都有了明显改善。高尔基染色发现,基因缺陷雌性小鼠CPS组的树突分支交点数相较于正常组虽有所减少,但同雄鼠一样,相较于野生型CPS组交点数均有所提高。CRHR1基因缺陷也改善了CPS诱导的的雌鼠树突棘密度降低。此外,CPS降低了野生型小鼠杏仁核突触相关蛋白PSD-95和突出素的表达水平,而对基因缺陷小鼠没有明显影响。细胞凋亡检测结果显示,基因缺陷小鼠CPS组的神经元凋亡指数相较于野生型CPS组,已明显降低。WB实验结果显示,在野生型小鼠中,相较于正常组,CPS组AKt、mTOR、p70S6K的磷酸化蛋白表达水平明显降低,而在基因缺陷小鼠中,除雌鼠p-mTOR以外,CPS组的上诉蛋白表达水平与正常组无明显差异,且相较于野生型CPS组均明显上升。结论:妊娠期慢性应激可以引起子代青春期小鼠出现抑郁样行为并存在性别特异性,妊娠期慢性应激可能通过抑制mTOR信号的激活引起杏仁核神经元损伤导致子代小鼠抑郁样行为.CRHR1基因缺陷改善了妊娠期慢性应激引起的子代抑郁样行为和HPA轴功能紊乱,杏仁核CRHR1在介导妊娠期慢性应激诱导杏仁核病理损伤中可能发挥重要作用,而这可能与Akt-mTORC1信号通路的变化有关。