研究背景:动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是导致心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)的主要原因之一,探明其关键病理机制对动脉粥样硬化性心血管疾病(Atherosclerosis cardiovascular disselleck产品ease,ASCVD)具有重要的防治意义。巨噬细胞在AS中起着多重作用,动脉粥样斑块中巨噬细胞的数量和表型参与AS的病理进程。巨噬细胞的活化具有两类经典表型:M1巨噬细胞,分泌促炎细胞因子(IL-1β、TNF-α、INOS)和趋化因子(CXCL9、CXCL10);M2 巨噬细胞,发挥抗炎(IL-10、IL-4、PPARγ)和免疫调节等功能。研究表明,铁稳态影响巨噬细胞的表型转变,并在AS中起到关键调控作用,但其机制不清楚。铁过载会引发细胞氧化应激、脂质过氧化和DNA损伤,从而导致基因组不稳定和DNA修复缺陷,最终损害细胞活力并发生铁死亡(Ferroptosis)。半胱氨酸-GSH-GPX4轴可以调控脂质过氧化,是抑制哺乳动物铁死亡的主要系统之一。其中半胱氨酸有外源性和内源性两条合成途径,外源性途径是由system xc-以胱氨酸的形式吸收细胞外半胱氨酸,内源性途径是由蛋氨酸经过甲硫氨酸循环和转硫途径从头合成半胱氨酸。胱硫醚-γ-裂解酶(Cystathionine-γ-lyase,CSE)是转硫途径的关键代谢酶selleck激酶抑制剂,由Cth基因编码。转硫途径是内源性半胱氨酸生成的主要途径,在铁过载影响巨噬细胞表型中的作用尚不清楚,深入探讨其机制可以为探寻靶向巨噬细胞的AS治疗方案提供新的线索。研究目的:1.证明CSE/转硫途径缺失对动脉粥样硬化发生发展的作用;2.阐明CSE/转硫途径是调控铁过载导致巨噬细胞表型转变的关键影响因素。研究方法:1.高脂喂养Cth-/-与ApoE-/-双敲除小鼠,分离主动脉,进行油红O染色后拍照。2.柠檬酸铁(Ammonium ferric citrate,FAC)处理 RAW264.7 巨噬细胞,CCK8检测细胞生存率,qPCR检测巨噬细胞M1(IL1-β、TNF-α、INOS)和M2(IL-4、IL-10、PPARy)标志分子表达水平。3.FAC 处理 RAW264.7 巨噬细胞,Western blot 检测铁代谢(Transferrin、Ferritin),线粒体铁代谢(FTMT)和铁自噬(NCOA4)蛋白表达水平,qPCR检测铁转运蛋白(FPN、TRFC)基因表达水平。4.FAC处理RAW264.7巨噬细胞,通过C11-BODIPY细胞荧光探针检测细胞ROS水平,MDA试剂盒检测MDA水平。5.FAC处理RAW264.7巨噬细胞,半胱氨酸试剂盒检测半胱氨酸含量。Western blot检测谷胱甘肽代谢(GPX4)水平和谷胱甘肽连接酶(GCLC、GCLM)基因水平。Western blot检测外源性半胱氨酸(SLC7A11)和内源性半胱氨酸代谢(CBS、CSE)水平。6.FAC和Erastin处理RAW264.7巨噬细胞,CCK8检测细胞生存率,半胱氨酸试剂盒检测半胱氨酸含量,GSH试剂盒检测GSH含量,MDA试剂盒检测MDA水平,Western blot 检测铁代谢(Transferrin、Ferritin)、线粒体铁代谢(FTMT),铁自噬(NCOA4)代谢、谷胱甘肽代谢(GPX4)、外源性半胱氨酸代谢(SLC7A11)和内源性半胱氨酸代谢(CBS、CSE)水平。7.给予野生型小鼠和Cth-/-小鼠注射右旋糖酐铁(Iron-dextran),提取并诱导骨髓巨噬细胞后,qPCR检测巨噬细胞M1(IL1-β、TNF-α、INOS)和M2(IL-4、IL-10、PPARγ)标志分子表达水平。8.给予野生型小鼠和Cth-/-型小鼠注射右旋糖酐铁(Iron-dextran),提取并诱导骨髓巨噬细胞后,qPCR检测影响谷胱甘肽连接酶(GCLC、GCLM)基因水平,Western blot检测铁代谢(NCOA4、FTMT、Ferritin)和谷胱甘肽代谢(GPX4)水平。9.FAC处理RAW264.7巨噬细胞后,铁死亡小分子化合物库再进行处理,CCK8检测72h生存率。实验结果:1.Cth-/-与ApoE-/-双敲除小鼠比ApoE-/-小鼠的主动脉动脉粥样硬化面积大。2.铁过载的巨噬细胞 M1(IL1-β、TNF-α、INOS)和 M2(IL-4、IL-10、PPARγ)表型中标志分子均有增加。3.铁过载升高了巨噬细胞中FTMT、Ferritin、Transferrin和FPN表达,降低了NCOA4和TFRC的表达。4.铁过载升高了巨噬细胞中脂质过氧化水平,GPX4和SLC7A11表达下降,CSE表达上升。5.相比单纯铁过载,缺乏外源性半胱氨酸的情况下铁过载,半胱氨酸含量、GSH含量、MDA水平和CSE表达升高,降低了巨噬细胞的铁代谢表达。6.铁过载WT小鼠的BMDM表型与RAW264.7细胞都处于M1(INOS、IL-1β、TNF-α)和M2(IL-10、PPARγ、IL-4)的动态平衡,铁过载Cth-/-小鼠的BMDM表型更倾向于M1(促炎型)。7.铁过载Cth-/-小鼠的BMDM相比RAW264.7细胞加重了铁自噬的表达并降低了GPX4的表达。结论:1.CSE的缺失加剧了动脉粥样硬化发展。2.铁过载促进巨噬细胞M1表型转化和M2交替激活状态,影响了巨噬细胞铁代谢和铁转运基因表达,升高了巨噬细胞中脂质过氧化水平,影响了巨噬细胞的半胱氨酸代谢。3.缺乏外源性半胱氨酸的情况下,铁过载seleniranium intermediate进一步影响了巨噬细胞的铁代谢和内源性半胱氨酸代谢。4.CSE的缺失加剧了铁过载巨噬细胞的炎症发展,影响了铁过载巨噬细胞半胱氨酸代谢和铁自噬。