随着社会经济的发展,全球因肝脏疾病死亡的患者越来越多。常见的肝脏疾病包括肝癌、肝硬化等。而肝脏外科手术是治疗终末期肝病的唯一有效的手段,主要包括肝脏切除和肝移植[1]。肝脏缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤是肝脏切除、肝移植等手术过程中发生肝损伤的重要原因。在缺血条件下,肝细胞由于氧供应中断,细胞内糖原和ATP的耗尽可直接发生死亡。而在再灌注期间,血液供应恢复导致的活性氧(reactive oxygen species,ROS)刺激和局部炎症加重了肝细胞死亡[2]。同时肝细胞死亡释放的损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern,DAMP)可以促进炎症的暴发,主要表现为巨噬细胞和中性粒细胞的浸润,以及炎症因子的释放,进一步加重了肝细胞的死亡[3]。肝脏病理表现为肝细胞肿胀、脂肪变性、空泡变性及点状坏死,血生化检查血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)增高。所以肝脏缺血再灌注损伤目前被认为是肝脏外科手术术后导致肝脏损伤的重要危险因素,但对其发生发展机制仍不甚清楚。目前认为在肝脏缺血再灌注过程中存在的多种细胞死亡方式是肝脏发生损伤的重要原因,包括坏死、凋亡、坏死性凋亡和铁死亡等[4,5],因此解析肝细胞死亡的潜在机制并进行相应干预对于临床治疗肝脏缺血再灌注损伤十分重要。铁死亡是新近发现的一种可被调控的细胞死亡方式,于2012年被Stockwell等人首次报导。铁死亡能够被小分子药物Erastin,RSL3等诱导产生,也可以被Liproxstatin-1,Ferrostatin-1等化合物所抑制,其特征为铁依赖的脂质过氧化物的累积,当累积的脂质过氧化物超出细胞所能承受的最大范围时,细胞就会发生铁死亡[6],电镜下其形态学特征表现为线粒体皱缩,线粒体膜密度增加,线粒体嵴减少,以及线粒体外膜破裂。铁死亡已被证明存在参与多种病理生理进程,包括肿瘤发生发展[7]、退行性疾病[8]、脑卒中[9]以及缺血再灌注损伤等,其潜在的生物学机制是维持ROS稳态系统的失衡:一方面脂质在二价铁的作用下发生芬顿反应Tamoxifen进而产生过量的ROS,另一方面由溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)/谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)介导的ROS清除系统不能及时清除过量的ROS,最终导致细胞发生死亡[10]。但目前对于肝细胞铁死亡调控机制的理解还不够透彻,因此完善对肝细胞铁死亡的精密调控可以为肝脏缺血再灌注损伤的治疗提供重要依据。DDX-/DHX-家族分子对于机体RNA的代谢十分重要,包括RNA的识别、修饰、剪接、转运、降解和翻译。肝细胞中的DDX-/DHX-家族分子同样在肝脏病理生理过程中扮演十分重要的角色,例如本课题组前期发现的DDX58(DEx D/H-box helicase58)能够在两个不同的层面调控肝癌的发生。一方面在DEN(diethylnitrosamine)诱导的肝脏炎癌转化模型中,DDX58能够抑制肝癌的发生;另一方面在STZ(streptozocin)加高脂饮食(high-fatty diet,HFD)诱导的小鼠肝癌中DDX58能够发挥促进作用。具体分子机制为DDX58在DEN诱导的肝脏炎癌转化模型中能够通过结合STAT3(signal transducers and activators of transcription 3)进而抑制JAK2(janus kinase 2)-STAT3相互作用以及IL-6(interleukin 6)效应信号通路活化,而在肝脏脂肪化进展而来的肝癌模型中DDX58通过结合AMPKα(AMP-activated protein kinaseα)进而抑制AMPKα与HMGCR(HMG-Co A reductase)的结合以及HMGCR的磷酸化,最终促进了胆固醇合成以及肝癌的发生[11]。DHX58(DEx H-box helicase 58)也被称为遗传学和生理学实验室蛋白2(laboratory of genetics and physiology 2,LGP2),与DDX58同属于RLH(RIG-I-like helixases)家族。RLH是典型的模式识别受体家族蛋白,在干扰素(interferon,IFN)刺激或者病毒感染后其表达发生指数级增长,并在抗病毒天然免疫应答中发挥关键作用。RLH识别病毒RNA成分后启动下游的抗病毒天然免疫信号通路并促使免疫细胞表达促炎症细胞因子和Ⅰ型IFN,最终清除病毒感染。DHX58的分子结构主要由两部分组成:RNA解螺旋酶结构域以及C端的抑制性结构域。RNA解螺旋酶结构域为DEx D/H家族保守结构域,主要负责水解ATP以及结合并松解RNA。C端的抑制性结构域通常被认为发挥抑制作用[12]。RNA解螺旋酶结构域与C端抑制性结构域能够以一种协同的方式识别双链RNA以及5’三磷酸化的RNA[13]。与其它RLH相比,DHX58缺少了N端的向下传递抗病毒天然免疫信号的CARD(caspase activation and recruitment domain)结构域,因此DHX58通常被认为是DDX58与MDA5(melanoma differentiation-associated gene 5)介导的天然免疫信号通路的调节因子。虽然DHX58相较于DDX58以及MDA5缺少了CARD结构域,但是在RLH家族中DHX58具备最强的RNA结合能力,所以它也被认为是非经典的RNA结合蛋白(RNA-binding protein,RBP)[14]。然而在肝脏缺血再灌注疾病中,DDX-/DHX-家族分子发挥的作用仍然未知。综合肝脏RNA-seq结果中RNA表达量以及差异表达倍数,我们发现在小鼠肝脏缺血再灌注模型中,DHX58是在肝脏内本底表达较高且手术后表达显著下降最为明显的DDX-/DHX-家族分子之一,而在肝脏缺血再灌注的发生发展中ROS的产生增多是最为明显的特征,因此我们进一步探究了DHX58在肝脏缺血再灌注模型中的表达降低是否依赖于微环境中过多的ROS产生。体外我们用双氧水模拟ROS刺激小鼠原代肝细胞以及人类肝细胞系HHL5,发现DHX58的表达显著降低。而在体内以及体外通过使用两种ROS的清除剂丁基羟基茴香醚(butylated hydroxyanisole,BHA)和N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acetylcystein,NAC)清除ROS后,DHX58的表达显著回升。因此,肝脏缺血再灌注过程中产生的ROS能够抑制DHX58的表达。随即我们构建了DHX58肝细胞特异性敲除小鼠,进行小鼠肝脏缺血再灌注造模,我们发现DHX58肝细胞特异性敲除小鼠相较于同窝对照小鼠其肝脏损伤显著增加,上述结果表明,DHX58能够抑制肝脏缺血再灌注损伤。我们进一步使用单细胞测序对肝脏缺血再灌注处理前后的对照小鼠以及DHX58肝细胞特异性敲除小鼠的肝脏单细胞样本进行分析,发现在小鼠肝脏缺血再灌注模型中,肝细胞Dhx58特异性敲除显著促进了肝细胞铁死亡信号通路的激活。对铁死亡相关指标进行分析,发现在肝脏缺血再灌注小鼠模型中,DHX58肝细胞特异性敲除显著促进了肝细胞铁死亡。以上结果强烈提示DHX58肝细胞特异性敲除极有可能通过促进肝细胞铁死亡进而促进肝脏缺血再灌注引起的肝脏损伤。接着我们通过向肝脏缺血再灌注小鼠模型体内注射细胞坏亡抑制剂、凋亡抑制剂和铁死亡抑制剂,发现铁死亡抑制剂完全逆转了因DHX58肝细胞特异性敲除所导致的肝脏缺血再灌注损伤的加重,进一步确认了DHX58肝细胞特异性敲除通过促进肝细胞铁死亡进而加重了肝脏缺血再灌注损伤。为了研究DHX58抑制肝细胞铁死亡的机制,并且考虑到DHX58具备很强的RNA结合能力,我们将野生型小鼠的肝脏进行了RIP-seq分析,并对Dhx58~(hep-/-)和对照(Dhx58~(fl/fl))小鼠的肝脏进行了蛋白组学的分析。RIP-seq检测结果表明有8432个基因的m RNA与DHX58蛋白发生了结合,而蛋白组学分析结果Berzosertib溶解度提示DHX58肝细胞特异性敲除后有214个蛋白表达发生显著改变。通过对DHX58所结合基因以及DHX58肝细胞特异性敲除后的差异表达蛋白取交集,再与铁死亡基因集比对,我们最终确定Gpx4,Hspb1以及Aox1可能为DHX58调控肝细胞铁死亡的下游靶标。进一步通过RIP-q PCR实验对以上结论进行验证,发现仅Gpx4 m RNA与DHX58发生了稳定的结合,确定GPX4 m RNA为DHX58的结合调控靶点。我们随后利用Western blot技Crop biomass术也确认了DHX58过表达显著促进了肝细胞内GPX4蛋白的表达,并且通过ribosome profiling实验我们进一步证实了DHX58通过增强Gpx4 m RNA的翻译效率进而促进了GPX4蛋白的表达。真核细胞中的m RNA代谢对于控制基因表达非常重要,这一过程严格受到m RNA转录后修饰的调控,例如RNA修饰中最常见的N6-甲基嘌呤(N~6-methyladenosine,m6A)修饰[15]。RNA的m6A修饰由一系列甲基转移酶所编辑,包括甲基转移样酶3(methyltransferase like 3,METTL3),甲基转移样酶14(methyltransferase like 14,METTL14)以及Wilms肿瘤1相关蛋白(Wilms’-tumor-1-associating protein,WTAP),它们也被称为“m6A writers”[16,17]。m6A修饰也能够被称为“m6A erasers”的去甲基化酶所清除,包括脂肪与肥胖相关基因(fat mass and obesity associated gene,FTO)和Alk B同源蛋白5(Alk B homolog 5,ALKBH5)[18,19],从而对RNA的m6A修饰进行调控。当RNA的m6A修饰编辑完成后,带有m6A修饰的RNA能够被“m6A readers”识别,包括YTH结构域家族分子(YTHDF1,YTHDF2,YTHDF3,YTHDC1和YTHDC2),这些readers可以参与调节RNA的剪接,转运,翻译以及稳定性等过程最终对RNA代谢和基因表达进行调控[20-23]。我们通过IP-MS技术鉴定出了在静息状态下与DHX58结合的分子,发现YTHDC2与DHX58结合并且蛋白评分最高。有研究报导YTHDC2能够以一种m6A修饰依赖的方式对RNA的稳定性和翻译过程进行调控[24,25],但是对YTHDC2所介导的m6A识别过程在铁死亡中发挥的作用目前仍不清楚。免疫共沉淀技术也确认了DHX58能够和YTHDC2组成性结合,并且二者发生结合的部位分别是DHX58的CTD(C-terminal domain,CTD)结构域和YTHDC2的R3H结构域。通过Me RIP-seq我们确认了Gpx4 m RNA带有m6A修饰,并且YTHDC2能够以一种m6A修饰依赖的方式促进GPX4蛋白的表达。随后我们通过ribosome profiling实验证实了YTHDC2通过促进Gpx4 m RNA的翻译效率进而促进了GPX4蛋白的表达。因此,静息状态下DHX58能够招募YTHDC2对带有m6A修饰的Gpx4 m RNA进行识别,通过促进Gpx4 m RNA的翻译效率进而促进GPX4蛋白的表达,最终抑制了肝细胞铁死亡以及其所导致的肝脏缺血再灌注损伤。IFN作用广泛,它除了在抗病毒天然免疫应答中发挥关键作用外,也能够抑制肿瘤的发生发展[26]。在IFN刺激机体时,细胞内一系列IFN诱导基因(IFN-stimulated genes,ISG)表达增高[27],其中DHX58就是经典的ISG,在IFN刺激后显著增高。考虑到DHX58抑制肝细胞铁死亡以及缓解肝脏缺血再灌注损伤的作用,我们对干扰素治疗肝脏缺血再灌注损伤进行了探究。通过对一系列铁死亡指标以及肝脏损伤指标的检测,我们发现IFN能够通过抑制肝细胞铁死亡进而缓解肝脏缺血再灌注损伤,并且这一过程依赖于DHX58蛋白的表达。因此,肝脏DHX58可能是肝脏缺血再灌注损伤的一个潜在的干预靶点,IFN能够通过诱导DHX58表达上调进而治疗肝脏缺血再灌注损伤。综上所述,在本研究中我们发现了静息状态下肝细胞内的DHX58能够结合Gpx4m RNA,并招募YTHDC2对Gpx4 m RNA以m6A依赖的方式进行识别,促进Gpx4m RNA的翻译效率进而促进GPX4的蛋白表达。在肝脏缺血再灌注过程中ROS通过抑制DHX58表达进而抑制了GPX4表达,促进了肝细胞铁死亡及铁死亡相关的肝脏缺血再灌注损伤。我们的研究揭示了DHX58抑制肝细胞铁死亡以及肝脏缺血再灌注损伤的机制,为肝脏缺血再灌注的干预提供了新的潜在依据。