背景和目的:非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种无过量饮酒史,以肝细胞脂肪变性和脂质贮积为特征的临床病理综合征,非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH)是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的一种高级形式,可发展为肝硬化和肝细胞癌(HCC)。据估计,全球超过25%的人口患有NAFLD,并有发展为NASH的风险,给社会造成了巨大的医疗和经济负担~([1])。与单纯的脂肪肝相比,NASH的特点是广泛的炎症和明显的肝细胞死亡,从而进一步促进肝纤维化的发展。NAFLD的基本治疗原则是改变生活方式、坚持运动、减轻体重等,目前尚没有明确的特效药物治疗,NASH发展过程中的分子机制仍有待充分了解。EF手性域家族成员D2(EFHD2),也被称为swiprosin-1,是钙结合EF-hand钙离子结合蛋白超家族的一员。EFHD2最早在淋巴细胞中被发现~([2]),在T淋巴细胞中,EFHD2与程序性细胞死亡1(PD-1)的相互作用是T细胞介导的细胞毒性和抗肿瘤免疫反应所必需的~([3])。除了淋巴细胞,越来越多的研究~([4-8]),包括我们的研究,已经发现EFHD2在巨噬细胞/单核细胞中高度表达,参与巨噬细胞的迁移和炎症因子的分泌。我们前期研究发现,EFHD2在NASH患者中表达增高,提示EFHD2可能参与了NASH的发展进程。在本文中,我们探究了EFHD2在NASH发展过程中的作用及相关分子机制,期待为后期NASH治疗药物的靶点提供新思路。实验方法及结果:1.NASH患者和NASH模型小鼠肝脏组织中EFHD2表达升高本实验在上海市第十人民医院收集了10个不患有NASH但有其他疾病的患者和10个患有NASH的患者肝脏样本,该研究得到了上海市第十人民医院伦理委员会的批准(批准文号:SHSY-IEC-4.1/19-126/01)。动物实验使用C57BL/6J小鼠,利用胆碱缺乏、左旋氨基酸高脂饲料(CDAHFD)和高脂肪高胆固醇饲料(HFHC)两种饮食诱导小鼠NASH模型,饲喂16周后收集小鼠肝脏样本。利用蛋白免疫印迹、RT-q PCR以及免疫组化等手段检测肝脏组织上EFHD2的表达,PLX-4720采购发现NASH患者和NASH模型小鼠肝脏组织中EFHD2的蛋白水平和m RNA水平均升高,该结果提示:EFHD2可能参与了NASH发展进程。2.EFHD2基因敲除可以缓解CDAHFD和HFHC诱导的小鼠NASH进程利用重组技术从含有EFHD2基因(C57BL/6J自交系)的细菌人工染色体(BAC)中生成一个基因靶向结构。用该结构转染E14 ES细胞,将靶向ES细胞注入C57BL/6J囊胚中,在种系中携带2-4号外显子缺失的靶向等位基因的小鼠被培育成EFHD2 KO小鼠,同窝出生的野生型(WT)小鼠作为对照。本实验分别使用了胆碱缺乏、左旋氨基酸高脂饲料(CDAHFD)饮食和高脂肪高胆固醇饲料(HFHC)饮食去构建小鼠NASH模型。两种饲料造模周期均为16周,造模结束后收集血清及肝脏组织。血清中ALT和AST活力检测结果显示,CDAHFD和HFHC饲喂后WT小鼠血清中ALT、AST活力显著上升,敲除EFHD2基因后ALT、AST活力下降。HE染色结果显示,CDAHFD和HFHC饲喂小鼠肝脏损伤明显,肝细胞排列紊乱并伴随出现大量脂滴泡,敲除EFHD2基因后可以缓解CDAHFD和HFHC饲喂导致的肝脏损伤。小鼠肝脏组织油红O染色、Masson染色和天狼星红染色结果显示CDAHFD和HFHC饲喂后WT小鼠出现了明显的肝脏脂肪变性和纤维化病变,敲除EFHD2基因后可以改善CDAHFD和HFHC饲喂导致medical worker的肝脏脂肪变性和纤维化。蛋白免疫印迹和RT-q PCR检测结果显示CDAHFD和HFHC饲喂后WT小鼠肝脏的炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)、细胞核因子-κB(NF-κB p65)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的蛋白表达水平均显著上升,相关趋化因子的m RNA表达水平显著上升,包括趋化因子(C-X-C基序)配体1(Cxcl1)、趋化因子(C-X-C基序)配体10(Cxcl10)和CC类趋化因子配体5(Ccl5),在EFHD2 KO小鼠中相关炎症因子和趋化因子的表达均下降。以上结果提示EFHD2敲除后可以缓解小鼠NASH进程。3.NASH小鼠中EFHD2主要表达在肝脏巨噬细胞前期实验中人类和小鼠肝脏的EFHD2免疫组化图可以初步判断EFHD2表达在肝脏非实质细胞,所以我们想进一步判断EFHD2主要来源于肝脏哪种类型的细胞。在公开的人类图谱数据库(www.proteinatlas.org)中查阅单细胞RNA测序数据可以看出,EFHD2在正常的人类肝脏组织中主要表达在肝脏枯否细胞(Kupffer cells,KCs)和T细胞。在NASH小鼠肝脏中,EFHD2和F4/80(巨噬细胞的标志物)免疫荧光双染结果显示,大约50%-60%的EFHD2阳性细胞与F4/80共染。然而,EFHD2和αSMA(肝脏星状细胞的标志物)的免疫荧光双染或CD3(T细胞的标志物)的免疫荧光双染表明,EFHD2阳性细胞几乎没有与αSMA或CD3共染,该结果提示NASH小鼠中EFHD2主要表达在肝脏巨噬细胞。4.髓系特异性敲除EFHD2延缓CDAHFD诱导的小鼠NASH进程通过CRISPR-Cas9技术构建Efhd2~(flox/flox)小鼠,Efhd2的2号外显子两侧插入了两个loxp位点,用于cre酶介导的切除,即为Efhd2~(flox/flox)Lysm-Cre小鼠,同窝出生的Efhd2~(flox/flox)作为对照组。普通饲料和CDAHFD饲喂16周后,处死小鼠收集血清及肝脏组织。血清中血脂相关指标TC、TG和肝脏转氨酶ALT、AST检测结果显示,CDAHFD饲喂后Efhd2~(flox/flox)小鼠中TC、TG、ALT、AST活力水平显著上升,在Efhd2~(flox/flox)Lysm-Cre小鼠中该作用被抑制。HE染色结果显示:饲喂CDAHFD后,与Efhd2~(flox/flox)小鼠相比,Efhd2~(flox/flox)Lysm-Cre小鼠肝脏损伤减轻,肝脏脂滴泡减少。小鼠肝脏组织冰冻切片油红O染色、Masson染色、天狼星红染色结果显示:饲喂CDAHFD后,与Efhd2~(flox/flox)小鼠相比,Efhd2~(flox/flox)Lysm-Cre小鼠的肝脏脂肪变性和纤维化程度显著减轻。蛋白免疫印迹结果显示,CDAHFD饲喂16周后,Efhd2~(flox/flox)小鼠肝脏相关炎症因子TNF-α、IL-6、NF-κB p65、MCP-1的蛋白表达水平均显著上升,而在髓系特异性敲除EFHD2后,相关炎症因子的蛋白表达水平下降。此外,CDAHFD饲喂16周后,相关趋化因子的m RNA表达水平显著上升,包括Cxcl1、Cxcl10和Ccl5,而在髓系特异性敲除EFHD2后,相关趋化因子的m RNA表达水平下降。接下来,我们使用多色流式细胞仪研究了髓系特异性敲除EFHD2对NASH条件下肝脏巨噬细胞/单核细胞群的组成和功能的影响。根据CD11b、F4/80、Ly6C、CD64、Mer Tk、CCR2、CD163和TIM4的不同表达,确定肝脏巨噬细胞/单核细胞亚群。有趣的是,我们发现在正常饮食或NASH条件下,Efhd2~(flox/flox)小鼠和Efhd2~(flox/flox)Lysm-Cre小鼠在NASH肝脏中的KCs(CD45~+CD11b~(int)F4/80~(hi))比例是相当的。然而,在NASH条件下,浸润性巨噬细胞(IMs,CD45~+CD11b~(hi)F4/80~(int))的比例被诱导上升约7倍。值得注意的是,在NASH条件下,Efhd2~(flox/flox)Lysm-Cre小鼠与Efhd2~(flox/flox)小鼠相比,IMs的比例下降了约50%。在全部KCs中,Efhd2~(flox/flox)小鼠肝脏中TIM4~(hi)-Res KCs(CD45~+CD11b~(int)F4/80~(hi)TIM4~(hi))的比例从约95%下降到约80%,这在Efhd2~(flox/flox)Lysm-Cre小鼠中得到部分阻止。相反,在NASH条件下,Efhd2~(flox/flox)小鼠肝脏中TIM4~(lo)-Mo KCs(CD45~+CD11b~(int)F4/80~(hi)TIM4~(lo))的比例增加了约5倍,而这种变化在Efhd2~(flox/flox)Lysm-Cre小鼠中被抑制了MRTX849临床试验。此外,与Efhd2~(flox/flox)小鼠相比,Efhd2~(flox/flox)Lysm-Cre中的M1样IMs(CD45~+CD11b~(hi)F4/80~(int)CD64~(hi)CD163~(lo))的比例明显更低。M2样IMs(CD45~+CD11b~(hi)F4/80~(int)CD64~(lo)CD163~(hi))的比例在Efhd2~(flox/flox)Lysm-Cre小鼠和Efhd2~(flox/flox)小鼠之间没有区别。以上结果提示髓系特异性敲除EFHD2可以缓解NAFLD的疾病进程。实验结论:1.EFHD2是NASH的一个关键启动因子,在NASH患者和小鼠模型中显著诱发。2.全身性敲除EFHD2可以缓解CDAHFD和HFHC诱导的小鼠NASH发展进程。3.在小鼠NASH模型中,EFHD2主要在肝脏内的巨噬细胞中表达;4.髓系特异性敲除EFHD2后可以缓解小鼠NASH发展的进程。